泡吳茱萸中吳茱萸堿?吳茱萸次堿和檸檬苦素含量測定方法研究

周勁松　陳俊禧　羅文英　馬恩耀　孔箭　侯皓然

摘要 [目的]建立HPLC法同時(shí)測定泡吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素含量的方法。[方法]采用Agilent 5 TC-C18（2）（250 nm×4.6 nm，5 μm） 色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水溶液（53∶47，V/V），等度洗脫，檢測波長為215 nm，流動(dòng)相的流速為1? mL/min，色譜柱的柱溫為25 ℃。[結(jié)果]在該檢測方法下吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素分離度良好，3種成分在對應(yīng)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素的平均回收率分別為98.0%、97.8%、97.3%（n=6）。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、分離度高、重復(fù)性良好，適用于泡吳茱萸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 泡吳茱萸;吳茱萸堿;吳茱萸次堿;檸檬苦素;含量;測定方法;質(zhì)量控制

中圖分類號(hào) R 284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）16-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.053

Determination of Evodiamine，Rutaecarpin and Limonin in Evodia rutaecarpa

ZHOU Jing-song1，CHEN Jun-xi2，LUO Wen-ying1 et al （1.Guangzhou Caizhilin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510360;2.Chinese Medicine Pieces Factory，Guangzhou Medicine Material Corporation，Guangzhou，Guangdong 510360）

Abstract [Objective]To establish the methods of determining the contents of evodiamine，rutacarpine and limonin in Evodia rutaecarpa by HPLC simultaneously.[Method]Agilent 5 TC-C18（2） （250 nm×4.6 nm，5 μm） chromatographic column was adopted，the mobile phase was acetonitrile-aqueous solution （53∶47，V/V），the same degree of elution，the detection wavelength was 215 nm，the flow rate of mobile phase was 1 mL/min，and the column temperature of chromatographic column was 25 ℃.[Result]The separation of evodiamine，rutaecarpin and limonin was good.The three components were linear in the corresponding range;the average recovery of evodiamine，rutaecarpin and limonin was 98.0%，97.8%，97.3% （n=6），respectively.[Conclusion]The method is simple，accurate and reproducible，and is suitable for the quality control of Evodia rutaecarpa.

Key words Evodia rutaecarpa;Evodiamine;Rutaecarpin;Limonin;Content;Measuring method;Quality control

基金項(xiàng)目 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFC1707100）;國家科技重大專項(xiàng)課題（2018ZX09721004-001）;2018年工業(yè)轉(zhuǎn)型升級（部門預(yù)算）項(xiàng)目（0714-EMTC-02-00576）。

作者簡介 周勁松（1975—），男，江蘇常州人，工程師，博士，從事中藥資源及質(zhì)量研究。*通信作者，主管藥師，從事中藥飲片質(zhì)量控制研究。

收稿日期 2020-01-21;修回日期 2020-02-24

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth]、疏毛吳茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang]或石虎[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth var.officinalis （Dode） Huang]的干燥近成熟果實(shí)[1]。吳茱萸具有降逆止嘔、散寒止痛、助陽止瀉的功效。藥用的吳茱萸主要以栽培為主，其產(chǎn)區(qū)主要分布在貴州、重慶、湖南、江西、廣西、浙江等地?，F(xiàn)代研究表明，吳茱萸中含有多種化學(xué)成分，主要為生物堿類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類、木脂素、黃酮、多糖等[2]，其中生物堿類為其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[3-4]。

對于吳茱萸炮制品自漢代起就有記載，同時(shí)吳茱萸的炮制方法全國各地方也收載了很多[5]?！侗静菥V目》中有提到：“茱萸性熱，能散能溫，苦熱能燥能堅(jiān)，故所治之癥，皆取其散寒溫中，燥濕解郁之功而已?！睂儆谂R床常用的中藥，其主要有效成分集中在檸檬苦素、吳茱萸次堿和吳茱萸堿等[6]，但由于吳茱萸辛苦，性熱，有小毒，不利于療效，故歷代中醫(yī)對其進(jìn)行了輔料和不同的炮制方法研究，使其降低毒副作用與增加療效[5]。熱水（開水）泡制亦為吳茱萸的傳統(tǒng)炮制方法之一。沸水泡制能夠有效降低吳茱萸的毒性，因此，采用沸水泡制方法制備而成的飲片品種“泡吳茱萸”仍在臨床使用。但現(xiàn)行的檢測方法當(dāng)中沒有泡吳茱萸的含量測定方法，而以2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的吳茱萸含量測定方法進(jìn)行檢測，存在分離度低的現(xiàn)象，不利于泡吳茱萸的質(zhì)量控制。該研究旨在建立泡吳茱萸的專屬含量測定方法，為泡吳茱萸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。

JA3003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;Secura 225D-1CN電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）;GZX-9070 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;DMF-4B手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司）;UltiMate3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）;KQ-300DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.1.2 材料。

吳茱萸堿對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110802-201710，含量以99.6%計(jì)）;吳茱萸次堿對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110801-201608，含量以99.7%計(jì)）;檸檬苦素對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110800-201707，含量以97.9%計(jì)）;甲醇、乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;乙腈（上海星可高純度溶劑有限公司）。

泡吳茱萸為自制，共有10批。所用吳茱萸藥材由廣州市藥材公司中藥飲片廠提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)高明副教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.]、石虎[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.officinalis （Dode） Huang] 或疏毛吳茱萸[Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.var.bodinieri （Dode） Huang] 的干燥近成熟果實(shí)。

飲片炮制方法：①Ⅰ法。參考《廣東省中藥炮制規(guī)范（1984版）》方法，取吳茱萸，洗凈，置沸水中略泡，撈出，曬干即得。②Ⅱ法。參考《江西省中藥飲片炮制規(guī)范（2008年版）》方法，取吳茱萸，用開水泡約1 h至頂端開口，再置鍋內(nèi)炒熱，灑入鹽水至發(fā)香氣，焙干。每100 kg吳茱萸，用食鹽3 kg。該試驗(yàn)所用樣品的信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備。

1.2.1.1 對照品溶液的制備。

分別精密稱取吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品、檸檬苦素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含吳茱萸堿80 μg、吳茱萸次堿50 μg、檸檬苦素100 μg的混合溶液，即得。

1.2.1.2 供試品溶液的制備。取本品粉末（過3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，稱定重量，靜置浸泡45 min，超聲處理30 min（超聲功率為300 W，超聲頻率為32 kHz），冷卻后，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 色譜條件。色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 nm×4.6 nm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（53∶47，V/V）;柱溫：25 ℃;檢測波長：215 nm;進(jìn)樣量：10 μL;流速：1? mL/min。

1.2.3 線性關(guān)系考察。

配制吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的對照品溶液，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的濃度分別為8.12、5.33、10.12 μg/mL。將上述對照品溶液分別進(jìn)樣2、5、10、15、25 μL進(jìn)行測定，記錄峰面積。以這3個(gè)成分峰面積為橫坐標(biāo)、含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗(yàn)。取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。

精密稱取6份批號(hào)5的泡吳茱萸粉末，使用“1.2.2”色譜條件進(jìn)行檢測，測定其峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱取批號(hào)5的泡吳茱萸粉末，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h按“1.2.2”色譜條件進(jìn)樣，測定其峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)。

取批號(hào)5的泡吳茱萸粉末6份適量，精密稱量，分別精密加入?yún)擒镙谴螇A、吳茱萸堿、檸檬苦素對照品溶液適量，按“1.2.1.2”方法制備成供試品溶液，測定吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素的含量，計(jì)算加樣回收率：回收率=（加標(biāo)后樣品中檢測含量-樣品中的檢測含量）/加入量×100%。

1.2.8 泡吳茱萸飲片含量測定。取表1中的10批泡吳茱萸樣品，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.2”色譜條件對每批樣品平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

以吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素峰面積為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的回歸方程分別為Y=0.013 7X+0.001 5（R2=0.999 4）、Y=0.003 3X+0.000 5（R2=0.999 5）、Y=0.355 9X+0.001 4（R2=0.999 1），表明3種成分在對應(yīng)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn) 按照“1.2.4”方法操作，計(jì)算得出吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素的RSD分別為1.22%、1.71%、0.25%，表明儀器精密度符合要求。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1.2.5”方法操作，計(jì)算得出吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素的RSD分別為0.37%、0.64%、0.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“1.2.6”方法操作，計(jì)算得出吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素的RSD分別為0.71%、0.82%、0.18%，表明樣品在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 按照“1.2.7”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），吳茱萸堿的平均回收率為98.0%，RSD=0.55%;吳茱萸次堿的平均回收率為97.8%，RSD=0.98%;檸檬苦素的平均回收率為97.3%，RSD=1.05%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

2.6 泡吳茱萸飲片含量測定

從表3～4可以看出，泡吳茱萸樣品中檸檬苦素含量為0.42%～0.70%，平均值0.54%;吳茱萸堿含量為0.36%～1.32%，平均值0.73%;吳茱萸次堿含量為0.19%～0.60%，平均值0.36%。對照品和樣品色譜圖見圖1。

3 結(jié)論與討論

從吸收波長選擇方面來看，采用紫外-可見分光光度計(jì)在200 ～ 320 nm 分析對照品和供試品溶液，發(fā)現(xiàn)在205 nm 處檸檬苦素有最大吸收，而吳茱萸堿、吳茱萸次堿在 225 nm 處有最大吸收，故該試驗(yàn)最終確定采用 215 nm 作為3個(gè)成分的最佳吸收波長進(jìn)行檢測。

從流動(dòng)相選擇方面來看，2015 年版《中華人民共和國藥典》以[乙腈 - 四氫呋喃（25-15）]-0.02%磷酸溶液（35-65）為流動(dòng)相，但是分析時(shí)間長，而且不穩(wěn)定，不同的含量測定試驗(yàn)之間差異較大。部分學(xué)者采用乙腈 - 水為流動(dòng)相主體[7]，變化比例或者添加磷酸緩沖液組成流動(dòng)相測定檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿[8-10]。該研究采用乙腈 - 水（53∶47，V/V）為流動(dòng)相，檸檬苦素的出峰時(shí)間由10.98 min 縮減到5.82 min，吳茱萸堿的出峰時(shí)間由22.74 min 縮減到7.89 min，吳茱萸次堿出峰時(shí)間由25.76 min 縮減到9.19 min，其出峰時(shí)間都在15 min 以內(nèi)，降低了檢測時(shí)間，提高了檢測效率，故選擇乙腈 - 水（53∶47）為流動(dòng)相。

綜上所述，該研究建立的HPLC泡吳茱萸含量檢測方

法，操作簡便，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，為吳茱萸炮制品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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