水楊酸?甲基茉莉酸與傷誘導(dǎo)對(duì)煙草sm-Nvas同源基因表達(dá)調(diào)控的初步研究

邵敏敏　何福收　陳同　王春臺(tái)　譚艷平

摘要 [目的]研究Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata這2種煙草中sm-Nvas同源基因分別在經(jīng)水楊酸（SA） 、甲基茉莉酸（MeJA）及傷誘導(dǎo)后的表達(dá)情況。[方法]采用Trizol法提取經(jīng)水楊酸、甲基茉莉酸及傷處理后的2種煙草葉片的總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)sm-Nvas同源基因的表達(dá)量并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。[結(jié)果]通過(guò)對(duì)煙草葉片中sm-Nvas同源基因的表達(dá)量分析，結(jié)果表明水楊酸、甲基茉莉酸及傷處理能對(duì)sm-Nvas同源基因的表達(dá)起調(diào)控作用。[結(jié)論]用SA、MJA和傷處理Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata煙草，發(fā)現(xiàn)sm-Nvas的表達(dá)量均有所增加。在處理8 h后其表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，在12～16 h其表達(dá)量的增加達(dá)到峰值。這對(duì)研究煙草的sm-Nvas及其同源基因的功能奠定重要的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甲基茉莉;水楊酸;傷害處理;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;sm-Nvas;同源基因;煙草

中圖分類(lèi)號(hào) Q 786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）16-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.028

Effects of Salicylic Acid，Methyl Jasmonate and Wound Induction on the Expression of sm-Nvas Homologous Genes in Tobacco

SHAO Min-min，HE Fu-shou，CHEN Tong et al （School of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Hubei Provincial Key Laboratory of Characteristic Plant Germplasm Protection and Utilization in Wuling Mountains，State Key Laboratory of Biotechnology，Wuhan，Hubei 430074）

Abstract [Objective]To study the expression of sm-Nvas homologous genes in two tobaccos，Nicotiana sylvestris and Nicotiana attenuata，after salicylic acid （SA），methyl jasmonate （MeJA） and wounding induction，respectively.[Method]Total RNA was extracted from the? two tobacco leaves treated with SA，MeJA and wounding using Trizol method，and then reverse transcribed into cDNA.The expression of sm-Nvas homologous gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and the data were analyzed.[Result]Based on analysis of the expression level of sm-Nvas homologous genes in tobacco leaves，it showed that salicylic acid，methyl jasmonic acid and wound treatment could regulate the expression of sm-Nvas homologous genes.[Conclusion]After SA，MJA and wounding treatment of Nicotiana sylvestris and Nicotiana attenuata tobacco，the expression of sm-Nvas homologous gene increased.After 8 hours of treatment，all the expression levels changed significantly，and reached the peak at about 12-16 hours.This will lay an important foundation for studying the function of sm-Nvas and its homologous genes in tobacco.

Key words Methyl jasmonic acid;Salicylic acid;Injury treatment;Real-time PCR;sm-Nvas;Homologous genes;Tobacco

基金項(xiàng)目 湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018CFB481）;中南民族大學(xué)研究生學(xué)術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2019sycxjj237）。

作者簡(jiǎn)介 邵敏敏（1990—），女，江蘇南通人，碩士研究生，從事植物遺傳學(xué)研究。*通信作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事煙草水稻功能基因的相關(guān)研究。

收稿日期 2020-02-24;修回日期 2020-03-26

煙草維管束發(fā)育相關(guān)基因sm-Nvas是一個(gè)受水楊酸（SA） 和甲基茉莉酸（MeJA）特異性誘導(dǎo)表達(dá)的基因。利用5′端缺失分析法把sm-Nvas基因啟動(dòng)子ATG+1～-463區(qū)域序列截成片段插入到含有GFP標(biāo)簽的雙元表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入W38型煙草植株。轉(zhuǎn)基因煙草中的綠色熒光主要集中在維管束組織中表達(dá)，說(shuō)明該基因特異表達(dá)于維管束中[1]。已經(jīng)有試驗(yàn)表明把該基因?qū)氲街参镏?，將?dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化、葉脈增多、莖和葉脈增粗等一系列表型變化[2-3]。sm-Nvas基因由1 392個(gè)堿基組成，編碼463個(gè)氨基酸。經(jīng)抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，該基因具有增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病以及油菜對(duì)菌核病抗性的特征[4]。sm-Nvas基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族成員，糖基轉(zhuǎn)移酶的功能涉及細(xì)胞中某些多糖的產(chǎn)生和生物大分子的代謝[5-6]，同時(shí)還能參與植物的抗性反應(yīng)[7]。在植物激素作用和植物抗性反應(yīng)方面，糖基轉(zhuǎn)移酶又與信號(hào)的感受和傳遞有關(guān)[8]。

水楊酸是一種植物內(nèi)源激素[9]，它在黃瓜、煙草和擬南芥中的升高伴隨著抗性的增加[10]。有研究表明，在蕎屬植物體中SA和MeJA相互協(xié)同可以抵御病原體的侵害[11]。在煙草和擬南芥體內(nèi)導(dǎo)入NahG基因會(huì)讓SA失活最終導(dǎo)致植物抵抗力明顯下降[12]。

一般而言，同源基因的功能具有相似性。在前期工作中，從Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata煙草中克隆了sm-Nvas同源基因。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度相同，都為1 392個(gè)堿基，但堿基序列不完全相同，Nicotiana sylvestris煙草與它的同源性為94%，而Nicotiana attenuata煙草的同源性為95%。編碼的463個(gè)氨基酸Nicotiana sylvestris有427個(gè)氨基酸相同，92%的同源性，Nicotiana attenuata有435個(gè)氨基酸相同，94%的同源性。為了研究這2個(gè)同源基因是否同樣受激素和傷誘導(dǎo)，該研究利用外源激素和傷害處理煙草葉片，分析同源基因表達(dá)情況，以期為后期進(jìn)一步研究sm-Nvas同源基因的特征和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata煙草。

1.1.2 試劑。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa公司）;SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）;Trizol試劑（Invitrogen公司）;三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)）;異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)）;無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)）;DEPC（Bio-shop公司）;1 mmol/L SA溶液;2 mmol/L SA溶液;1 mmol/L MeJA溶液;2 mmol/L MeJA溶液。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)。以煙草中跨一段內(nèi)含子的ACTIN基因作為對(duì)照內(nèi)參來(lái)檢測(cè)分析基因表達(dá)情況。ACTIN的正向引物：5′-GCCATCAGCAACAAATACCA-3′，反向引物：5′-GCCTCATCACCAACATAAGCA-3′;sm-Nvas的正向引物：5′-CCTTGACTGGTTGGGTTGGT-3′，反向引物：5′-AACGAAGGCAAATCCCGAGG-3′。

1.2.2 煙草植株的處理。對(duì)Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata煙草植株分別用1 mmol/L SA溶液、2 mmol/L SA溶液、1 mmol/L MeJA溶液、2 mmol/L MeJA溶液以及傷害處理葉片背面，并用水溶液處理作對(duì)照，處理時(shí)間分別為8、12、16和20 h。

1.2.3 Trizol 法提取葉片的總RNA。取被處理的葉片0.1 g于1.5 mL的EP管中加液氮研磨成粉末，加入1 mL Trizol振蕩均勻，冰上靜置8 min，加入200 μL三氯甲烷劇烈振蕩10 min 后4 ℃冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移450 μL 上清液到新的1.5 mL EP管中，加300 μL異丙醇輕柔混勻，室溫靜置8 min，4 ℃冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心10 min棄上清液，在沉淀中加700 μL 75%乙醇懸浮沉淀，4 ℃ 冷凍10 000 r/min離心5 min棄上清，重復(fù)洗滌1次。上清液去除干凈，通風(fēng)干燥3 min至沉淀變得半透明，加入20 μL DEPC處理水，溶解后于65 ℃變性15 min后迅速置于冰上冷卻，再放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 去除基因組DNA與逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取上一步提取出來(lái)的1 μg 總RNA用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中DNaseⅠ去除基因組DNA，后用試劑盒里的Prime Script RT Enzyme Mix I和RT Prime Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.5 cDNA的ACTIN檢測(cè)。把反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用ACTIN引物進(jìn)行PCR反應(yīng)進(jìn)行cDNA質(zhì)量檢測(cè)，擴(kuò)增體系為15 μL，ACTIN擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán);12 ℃保存。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量 PCR。將cDNA稀釋2倍，以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，cDNA為模板采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)煙草sm-Nvas同源基因的表達(dá)量，15 μL擴(kuò)增體系為4.5 μL 水 、7.5 μL SYBR Mix、1 μL 引 物 Mix 和 2.0 μL 的cDNA。反應(yīng)程序?yàn)?5? ℃預(yù)變性10 s;95? ℃變性5 s，60? ℃退火10 s，40 個(gè)循環(huán);72? ℃延伸40 s，收集熒光信號(hào)并觀察熔解曲線(xiàn)，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA的檢測(cè)

利用內(nèi)參基因ACTIN 檢測(cè)cDNA 質(zhì)量可用，并且無(wú)基因組DNA污染（圖1）。條帶單一，大小為250 bp左右。因?yàn)閏DNA的模板量濃度有一些差異，導(dǎo)致目的條帶的明暗程度不一樣，經(jīng)調(diào)整cDNA模板濃度后可進(jìn)行下一步的熒光定量PCR試驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果 該試驗(yàn)的煙草sm-Nvas同源基因檢測(cè)成功，熔解曲線(xiàn)峰值單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增。以未處理過(guò)的煙草葉片作為參照，不同激素處理和傷害處理過(guò)的葉片為試驗(yàn)樣本。用水楊酸處理Nicotiana sylvestris煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)情況如圖2，結(jié)果顯示，1 mmol/L水楊酸處理Nicotiana sylvestris煙草8 h后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量開(kāi)始升高，12 h持續(xù)升高，到了16 h達(dá)到最高峰值然后開(kāi)始下降，到20 h時(shí)已經(jīng)降到了比較低的水平，但是仍然高于對(duì)照組。與1 mmol/L SA處理的結(jié)果相似，2 mmol/L水楊酸處理8 h后sm-Nvas同源基因開(kāi)始升高，到12 h時(shí)增加速度比較緩慢，16 h后sm-Nvas同源基因表達(dá)量迅速升高到了最大峰值然后在20 h后下降。

用MeJA處理Nicotiana sylvestris煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量情況如圖3，結(jié)果顯示，1 mmol/L的MeJA處理Nicotiana sylvestris后8 h時(shí)sm-Nvas同源基因的表達(dá)量開(kāi)始升高，12 h表達(dá)量穩(wěn)定增加直到16 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高峰值然后開(kāi)始下降，20 h時(shí)迅速下降到比8 h還要低。與1 mmol/L MeJA處理情況比較相似，2 mmol/L MeJA處理的葉片中sm-Nvas同源基因的增長(zhǎng)和下降趨勢(shì)一致，只是整體的增加量并沒(méi)有1 mmol/L MeJA處理的增長(zhǎng)量大。

用SA處理Nicotiana attenuata煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)情況如圖4，結(jié)果顯示，1 mmol/L SA處理Nicotiana attenuata葉片8 h后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量有一些上升但并不明顯，到12 h后sm-Nvas同源基因相較于8 h已經(jīng)有了比較高的表達(dá)量，直到16 h時(shí)無(wú)明顯增加，而到20 h同源基因表達(dá)量已經(jīng)下降，但其表達(dá)量依舊高于對(duì)照組。與1 mmol/L SA處理的情況略有不同，2 mmol/L SA處理8 h后sm-Nvas同源基因表達(dá)量升高，12 h迅速達(dá)到最高峰值，在16 h后迅速下降。

用MeJA處理Nicotiana attenuata煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量情況如圖5，結(jié)果顯示，1 mmol/L MeJA處理8 h后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量逐步升高，16 h達(dá)到最高峰值，在20 h后迅速下降，稍高于對(duì)照組。與1 mmol/L MeJA處理結(jié)果稍微不同的是，2 mmol/L MeJA處理8 h后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量升高，到12 h增加的幅度很緩慢，16 h 明顯增加，但20 h又迅速下降。

損傷處理Nicotiana sylvestris煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量如圖6，結(jié)果顯示，損傷處理8 h后sm-Nvas同源基因升高到12 h表達(dá)量略微下降，到了16 h表達(dá)量降低到比對(duì)照組還要低的程度后又在20 h時(shí)緩慢回升，但是依舊低于對(duì)照組。

損傷處理Nicotiana attenuata煙草葉片后sm-Nvas同源基因的表達(dá)量情況如圖7，結(jié)果顯示，損傷處理后8 h表達(dá)量升高，到12 h表達(dá)量持續(xù)增加到達(dá)最大峰值，在16 h后降低，直到20 h后表達(dá)量低于對(duì)照組。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)研究了水楊酸、甲基茉莉酸以及損傷處理煙草Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata葉片后，其sm-Nvas同源基因表達(dá)量的變化。直系同源基因通常是由同一個(gè)祖先進(jìn)化而來(lái)的，一般而言是一些功能比較重要的，例如一些酶和調(diào)控重要生命活動(dòng)的蛋白類(lèi)，通常這類(lèi)蛋白的進(jìn)化程度小，進(jìn)化速度也很慢。該類(lèi)基因一般在序列上保守性很高，功能相同或相近，調(diào)控途徑也相似[13]。研究結(jié)果顯示不同濃度的SA和MeJA對(duì)sm-Nvas同源基因表達(dá)量的變化略有不同，但都表現(xiàn)出相似的特征，說(shuō)明同源基因也具有被SA、MeJA誘導(dǎo)的特征，這一特性與sm-Nvas相似。在煙草Nicotiana sylvestris中，1 mmol/L SA處理8～12 h后sm-Nvas同源基因表達(dá)量的變化比2 mmol/L SA處理的要明顯，16～20 h后表達(dá)量的變化值低于2 mmol/L SA處理的變化值，但2種濃度的SA處理后變化趨勢(shì)相同，都是在16 h后達(dá)到了表達(dá)量的最高水平;而用MeJA處理，sm-Nvas同源基因表達(dá)量都升高，且16 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大峰值而后迅速降低。相對(duì)而言，1 mmol/L處理的表達(dá)量要比2 mmol/L處理的表達(dá)量增加明顯，可能是因?yàn)榈蜐舛鹊募に卣T導(dǎo)能力更強(qiáng)。在煙草Nicotiana attenuata中，SA處理后12 h表達(dá)量就開(kāi)始增加達(dá)到最高值，而MeJA在16 h的表達(dá)量才是峰值。該研究結(jié)果表明，這2種激素處理16 h后，同源基因的表達(dá)量才出現(xiàn)下降，推測(cè)可能是激素已經(jīng)被煙草自身降解消耗導(dǎo)致表達(dá)量迅速下降。有研究表明水楊酸（SA）和乙酰水楊酸（ASA）是茉莉酸（JA）誘導(dǎo)目標(biāo)基因mRNA和蛋白質(zhì)合成的有效抑制劑[14]。對(duì)擬南芥用SA和JA共同處理會(huì)導(dǎo)致JA介導(dǎo)的防御素基因誘導(dǎo)的喪失[15-16]。SA和JA之間存在相互拮抗作用，可能導(dǎo)致不同激素處理的煙草同源基因出現(xiàn)的峰值有所差異，煙草Nicotiana attenuata中的sm-Nvas同源基因可能優(yōu)先參與的是SA途徑，所以在12 h就能快速達(dá)到高峰。

損傷處理后，sm-Nvas同源基因表達(dá)量在8～12 h略有增加，但到了16 h開(kāi)始下降，最終值比對(duì)照組還低。由于水楊酸和甲基茉莉酸參與植物體防御系統(tǒng)相關(guān)途徑[17]，在損傷處理后sm-Nvas同源基因表達(dá)量也開(kāi)始出現(xiàn)了一定量的升高，可以推測(cè)sm-Nvas同源基因可能與植物體的防御通路相關(guān)。番茄在受到機(jī)械損傷或是病蟲(chóng)侵害下，轉(zhuǎn)錄MYC2激活JA響應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物抗性[18]。其中的損傷修復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要乙烯和JA共同作用，在傷口反應(yīng)過(guò)程中調(diào)節(jié)蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)[19]。在接下來(lái)的工作中，將2種激素和損傷處理兩兩結(jié)合，進(jìn)一步研究共同作用下sm-Nvas同源基因在RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，為研究其同源基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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