2種早竹造癭害蟲植物源誘控技術(shù)

耿顯勝，舒金平，張 威，石 堅

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2. 浙江省德清縣森林病蟲防治檢疫站，浙江 德清 313200)

化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，在殺死害蟲的同時也殺死了天敵昆蟲等非靶標(biāo)生物，且環(huán)境中殘留的農(nóng)藥威脅人類健康，造成害蟲抗藥性（resistance）、再增猖獗（resurgence）和農(nóng)藥殘留（residue）的“3R”問題。害蟲植物源誘控技術(shù)利用靶標(biāo)害蟲特別敏感或偏好的揮發(fā)物組合誘殺靶標(biāo)害蟲，不僅能避免化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，緩解“3R”問題，且防治效果好，使用簡單，節(jié)約成本[1-3]。植物源誘控技術(shù)已在橘小實蠅（Bactrocera dorsalis(Hendel)）[1,4]、柑橘大實蠅（Bactrocera minax(Enderlein)）[1]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera(Hübner)）[5]、蘋果蠹蛾（Cydia pomonella(L.)）[6]、紅脂大小蠹（Dendroctonus valensLeConte）[7]、松墨天牛（Monochamus alternatusHope）[8]等害蟲規(guī)?；乐沃型茝V應(yīng)用，產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

造癭害蟲是早竹（Phyllostachys praecoxC. D.Chu et C. S. Chao）林的重要害蟲，在浙江德清縣早竹林嚴(yán)重發(fā)病林地危害率高達(dá)70%[9]，且近年來其危害呈上升的趨勢。通過對蟲癭昆蟲的飼養(yǎng)和物種鑒定，明確了早竹造癭害蟲有竹癭廣肩小蜂（Aiolomorphus rhopaloidesWalker）、剛竹泰廣肩小蜂（Tetramesa phyllostrachitisGahan）、竹泰廣肩小蜂（Tetramesa bambusaePhilips）等[9-10]，而竹泰廣肩小蜂和剛竹泰廣肩小蜂數(shù)量最多，是主要的早竹造癭害蟲。剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的卵、幼蟲、蛹和初羽化成蟲均生活于封閉蟲癭的內(nèi)部，隱蔽危害，防治困難。每年4—5月份，剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的成蟲羽化出孔[9]，并在其短暫的成蟲期完成交配、產(chǎn)卵和寄主選擇行為。羽化出孔的成蟲脫離蟲癭的保護(hù)，是其生活史中最薄弱的時期，在此階段防控更易獲得成功。同時，造癭害蟲的寄主選擇行為主要由寄主揮發(fā)物來調(diào)控，故發(fā)展植物源誘控技術(shù)，在造癭害蟲成蟲羽化出孔后誘殺，可望解決造癭害蟲難以防治的問題。

研究表明，揮發(fā)物為基礎(chǔ)的誘控技術(shù)誘捕效果受到揮發(fā)物配方和劑量、揮發(fā)物釋放速率、誘捕器類型、誘捕器懸掛高度等因素的影響[11-13]，只有充分優(yōu)化整合這些影響因素，才能最大限度提高害蟲誘控效果。本研究使用6種早竹揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品和早竹提取物制備誘芯，通過林間生物測定法篩選對早竹造癭害蟲有引誘效果的揮發(fā)物配方；設(shè)置不同類型的誘捕器和不同的懸掛高度，比較誘捕器的類型和懸掛高度對誘捕效果的影響；通過監(jiān)測林間造癭害蟲的種群動態(tài)，確定剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的林間活動規(guī)律。研究結(jié)果為早竹造癭害蟲植物源誘控技術(shù)研發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑和誘捕器

水楊酸甲酯（CAS號119-36-8）、β-紫羅蘭酮（CAS號14901-07-6）、順-3-己烯-1-醇（CAS號928-96-1）、反-2-己烯醛（CAS號6728-26-3）、(E)-3,7,11,15-四 甲 基-2-十 六 碳 烯-1-醇（CAS號150-86-7）和反-2-己烯醇（CAS號 928-95-0）購于Sigma-Aldrich公司。瓊脂糖（CAS號9012-36-6）購于Genview公司。石油醚（CAS號8032-32-4）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。三角形誘捕器、小船型誘捕器、桶型誘捕器、夜蛾誘捕器（不含誘芯）、實蠅誘捕器（不含誘芯）和全型空白誘芯購于北京中捷四方生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 早竹小枝揮發(fā)物的提取和成分分析 在浙江德清縣山民村早竹造癭害蟲生態(tài)調(diào)控示范林采集無病蟲害的早竹小枝，帶回實驗室，自來水洗凈后放入瓷盤中，并將瓷盤置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，80 ℃下烘干，使用萬能研磨儀（天津泰斯特有限公司）研磨成粉末。

稱取早竹粉末100 g，并按液料比8∶1的比例加入純凈水，采用水蒸氣蒸餾法提取早竹揮發(fā)物的蒸餾液，蒸餾液按1∶1的比例加入石油醚萃取，獲取早竹小枝揮發(fā)物，并保存于-20 ℃冰箱中備用。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)檢測揮發(fā)物的化學(xué)成分，檢測時使用的色譜條件和質(zhì)譜條件同文獻(xiàn)[14]。GC-MS獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫NIST 08檢索，并結(jié)合質(zhì)譜圖中的分子離子峰和碎片離子峰定性分析揮發(fā)物的化學(xué)成分。

1.2.2 不同植物源引誘劑引誘效果監(jiān)測 將購買的順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、(E)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、反-2-己烯醇、水楊酸甲酯和早竹提取物使用石油醚稀釋成0、1 000、10 000倍3個濃度梯度；β-紫羅蘭酮使用石油醚稀釋成1 000、10 000、100 000倍3個濃度梯度。稀釋液使用移液器取130 μL加入到全型空白誘芯內(nèi)，待其揮發(fā)完后再重復(fù)添加1次。將誘芯用細(xì)鐵絲固定在三角形誘捕器上，完成誘捕器的制作。試驗以添加石油醚的全型空白誘芯作為對照，每種誘芯設(shè)置5個重復(fù)。

在生態(tài)調(diào)控示范林冠層的下層懸掛誘捕器誘捕早竹造癭害蟲。試驗于2018年4月2日開始，至2018年5月14日結(jié)束，期間于4月23日更換誘芯和粘蟲板1次。4月23日和5月14日統(tǒng)計粘蟲板上早竹造癭害蟲的數(shù)量，相同編號誘捕器2次統(tǒng)計結(jié)果合并，為該誘捕器的誘蟲量。

1.2.3 誘捕器不同懸掛高度誘捕效果監(jiān)測 參考滕小慧等[15]的方法制作誘芯。使用微波爐制備2%的瓊脂糖凝膠400 mL，將凝膠置于90℃的水浴鍋內(nèi)保溫，使膠液的溫度保持在90℃。將水楊酸甲酯和順-3-己烯-1-醇按30∶1的比例混合，取44.44 mL混合液緩慢加入到保溫的凝膠中，邊加入邊攪拌。加入完成后，再劇烈攪拌10 min。將混合均勻的凝膠倒入50 mL的離心管內(nèi)，每管25 mL，待凝膠完全凝固后蓋上離心管蓋，于4 ℃冰箱暫存。誘芯在使用前用電烙鐵在離心管管壁和蓋子上打5個直徑為5 mm的小孔，并用細(xì)鐵絲將其固定在三角形誘捕器上，完成誘捕器制作。

在生態(tài)調(diào)控示范林同株早竹冠層的上層、中層和下層分別懸掛1個誘捕器，共設(shè)置4個重復(fù)。試驗于2019年4月10日開始，至2019年6月11日結(jié)束，期間于4月30日更換誘芯和粘蟲板1次。4月30日和6月11日統(tǒng)計粘蟲板上早竹造癭害蟲的數(shù)量，相同編號誘捕器2次統(tǒng)計結(jié)果合并，為該誘捕器的誘蟲量。

1.2.4 不同類型誘捕器誘捕效果監(jiān)測 在2 mL的離心管內(nèi)放入一個全型空白誘芯，將1 mL水楊酸甲酯和順-3-己烯-1-醇的混合物（30∶1）添加到離心管內(nèi)，完成誘芯的制作。將誘芯用細(xì)鐵絲固定在三角形誘捕器、小船型誘捕器、桶型誘捕器、夜蛾誘捕器（不含誘芯）和實蠅誘捕器（不含誘芯）上，完成誘捕器的制作。

在生態(tài)調(diào)控示范林選取6個區(qū)組懸掛誘捕器，每個區(qū)組于早竹冠層的下層懸掛5種類型誘捕器各1個。試驗于2019年4月10日開始，至2019年6月11日結(jié)束，期間于4月30日更換誘芯和粘蟲板1次。4月30日和6月11日統(tǒng)計粘蟲板上早竹造癭害蟲的數(shù)量，相同編號誘捕器2次統(tǒng)計結(jié)果合并，為該誘捕器的誘蟲量。

1.2.5 早竹林造癭害蟲種群時序動態(tài)監(jiān)測 誘芯的制作方法同1.2.3節(jié)，但將盛放凝膠的載體改成直徑6 cm的培養(yǎng)皿底，并將培養(yǎng)皿底粘在粘蟲板的中心，完成誘捕器的制作。在試驗早竹林冠層的下層懸掛5個誘捕器。試驗于2019年3月17日開始，每周更換誘芯和粘蟲板2次，更換的粘蟲板統(tǒng)計其粘附的造癭害蟲數(shù)量，試驗至6月11日結(jié)束。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2010和SPSS 23.0軟件處理獲得的數(shù)據(jù)。按照沈佐銳[16]的方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)變換，并進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗。若變換后的數(shù)據(jù)依然方差不整齊，則對數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物源引誘劑引誘效果監(jiān)測

本研究分析、鑒定出順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、(E)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、反-2-己烯醇、β-紫羅蘭酮、水楊酸甲酯等早竹揮發(fā)物。購買上述6種揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品，用于早竹造癭害蟲的林間誘捕試驗。非參數(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)，不同引誘劑對剛竹泰廣肩小蜂引誘效果差異顯著（χ2=34.97；P=0.028＜0.05）。除了早竹提取物原液、早竹提取物10 000倍液、反-2-己烯醛原液、反-2-己烯醛10 000倍液、β-紫羅蘭酮1 000倍液、β-紫羅蘭酮100 000倍液和(E)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇1 000倍液這7組引誘劑誘捕的剛竹泰廣肩小蜂數(shù)量與對照組間的差異不顯著外（P＞0.05），其它14組引誘劑誘捕的剛竹泰廣肩小蜂數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.05）。水楊酸甲酯原液、順-3-己烯-1-醇原液和反-2-己烯醛1 000倍液作為引誘劑的誘捕器誘捕剛竹泰廣肩小蜂數(shù)量最多（圖1），分別為154.40±129.04、35.20±35.75、24.00±20.30頭，遠(yuǎn)高于對照誘捕器的誘蟲量（3.75±1.71頭）。

非參數(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)，不同引誘劑對竹泰廣肩小蜂的引誘效果差異顯著（χ2=39.62；P=0.008＜0.05）。反-2-己烯醛原液和1 000倍液、順-3-己烯-1-醇10 000倍液、β-紫羅蘭酮1 000倍液和100 000倍液、水楊酸甲酯10 000倍液、早竹提取物1 000倍液和反2-己烯醇1 000倍液8組引誘劑誘捕器誘捕的竹泰廣肩小蜂數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05）。其中反-2-己烯醛1 000倍液、順-3-己烯-1-醇10 000倍液和β-紫羅蘭酮1 000倍液作為引誘劑的誘捕器誘捕竹泰廣肩小蜂數(shù)量最多（圖1），分別為29.50±28.43、25.67±16.26和20.25±3.95頭，高于對照誘捕器的誘蟲量（8.00±2.16頭）。

2.2 誘捕器不同懸掛高度誘捕效果監(jiān)測

生態(tài)調(diào)控示范林內(nèi)于早竹冠層的上層、中層和下層分別懸掛誘捕器，比較誘捕器的不同懸掛高度對2種早竹造癭害蟲誘捕效果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，冠層的上層誘捕的造癭害蟲數(shù)量多于冠層的中層，而冠層的中層誘捕的造癭害蟲數(shù)量多于冠層的下層（圖2）。方差分析表明，誘捕器懸掛于不同高度時，誘捕的造癭害蟲數(shù)量間存在顯著差異（F=7.675，P=0.022＜ 0.05），冠層的上層和中層誘捕的造癭害蟲數(shù)量顯著多于冠層的下層（P＜0.05），而冠層的上層和中層誘捕的造癭害蟲數(shù)量間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同類型誘捕器對2種早竹造癭害蟲的誘捕效果

采用5種不同類型的誘捕器在生態(tài)調(diào)控示范林6個區(qū)組進(jìn)行誘捕試驗，發(fā)現(xiàn)小船型誘捕器和三角形誘捕器誘捕到更多的造癭害蟲，而桶型誘捕器、實蠅誘捕器和夜蛾誘捕器誘捕的造癭害蟲數(shù)量少（圖3）。隨機(jī)區(qū)組方差分析表明，不同類型誘捕器誘捕的造癭害蟲數(shù)量間差異顯著（F=20.042，P=0.000＜ 0.05）；而區(qū)組間的差異不顯著（F=0.794，P=0.566＞0.05）。統(tǒng)計分析還發(fā)現(xiàn)，小船型誘捕器的誘蟲量顯著多于三角形誘捕器的誘蟲量（P＜0.05），而三角形誘捕器的誘蟲量顯著多于桶型誘捕器（P＜0.05）、實蠅誘捕器（P＜0.05）和夜蛾誘捕器的誘蟲量（P＜0.05）。

圖1 不同揮發(fā)物作為引誘劑誘捕的造癭害蟲的數(shù)量Fig. 1 The number of 2 species of gall-inducing pests trapped by different volatiles as attractants

圖2 誘捕器不同懸掛高度的誘捕效果Fig. 2 The trapping effects of three different trap heights

2.4 早竹林2種造癭害蟲種群時序動態(tài)

利用篩選出的引誘劑配方監(jiān)測剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂林間的種群時序動態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，剛竹泰廣肩小蜂成蟲開始活動的時間比竹泰廣肩小蜂成蟲早，且活動的歷期較竹泰廣肩小蜂長，但2種造癭害蟲成蟲活動的高峰期較接近。剛竹泰廣肩小蜂成蟲于4月2日開始被誘捕到，誘捕高峰期為4月23日到5月3日，5月24日后再無該蟲被誘捕到；竹泰廣肩小蜂成蟲于4月20日開始被誘捕到，誘捕高峰期為4月20日到4月30日，5月21后再無該蟲被誘捕到（圖4）。

3 討論

植食性昆蟲選擇寄主植物的行為可分為前后兩個連續(xù)階段，即搜尋階段和接觸試探階段，在搜尋階段，植物釋放特異性的揮發(fā)物是植食性昆蟲搜尋寄主植物的重要信號物質(zhì)，昆蟲利用嗅覺感受器官對這些物質(zhì)進(jìn)行識別而到達(dá)植物[17-18]。因此，植物揮發(fā)物在調(diào)節(jié)昆蟲的寄主選擇行為中發(fā)揮重要功能，故可以利用植物揮發(fā)物的活性組分來誘殺害蟲[3,19]。

植物揮發(fā)物是植物在環(huán)境溫度下釋放到空氣中的小分子代謝物，目前已鑒定出的植物揮發(fā)物超過1 700種，而能夠影響昆蟲行為的植物揮發(fā)物達(dá)數(shù)百種[3,20-21]。鑒定影響昆蟲行為的植物揮發(fā)物主要采用觸角電位技術(shù)、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)、實驗室生物測定、林間生物測定等技術(shù)方法[3]。本研究使用6種早竹來源揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品和早竹提取物作為候選引誘劑，采用林間生物測定法，測定了7種不同候選引誘劑的引誘效果。結(jié)果表明，水楊酸甲酯原液強(qiáng)烈地引誘剛竹泰廣肩小蜂，用其作為引誘劑的誘捕器誘捕剛竹泰廣肩小蜂數(shù)量的平均值為154.40頭，最大值為379頭。研究還發(fā)現(xiàn)，使用低濃度的反-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、β-紫羅蘭酮和反-2-己烯醇作為引誘劑的誘捕器誘捕到較多的竹泰廣肩小蜂，且誘捕量顯著高于對照組（P＜0.05）。因此，基于剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的誘捕量，初步確定以水楊酸甲酯和順-3-己烯-1-醇30∶1比例的混合物作為剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的引誘劑配方。

圖3 5種不同形狀誘捕器的誘捕效果Fig. 3 The trapping effects of 5 different shapes traps

圖4 剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂種群時序動態(tài)Fig. 4 The temporal dynamics of the populations of T. phyllostrachitis and T. bambusae

揮發(fā)物為基礎(chǔ)的誘控技術(shù)的誘捕效果除了受揮發(fā)物配方和劑量影響外，誘捕器類型和誘捕器懸掛高度也顯著影響誘捕效果[12-13]。翟小偉等[12]比較了誘捕器顏色、類型、放置位置等因素對蘋果蠹蛾誘捕效果的影響，發(fā)現(xiàn)三角形誘捕器和水瓶式誘捕器的誘蟲效果最好，且誘捕器懸掛在樹冠中部的誘蟲量顯著高于樹冠的上部。李麗莉等[13]比較了不同高度、不同方位、不同誘芯劑量、不同類型誘捕器對梨小食心蟲（Grapholitha molestaBusck）誘蟲量的影響，發(fā)現(xiàn)7種類型誘捕器中以三角形誘捕器的誘捕效果最好，且誘捕器懸掛高度越高誘捕效果越好。本研究使用水楊酸甲酯和順-3-己烯-1-醇混合物配方（30∶1）制備成誘芯，用于比較誘捕器懸掛高度和誘捕器類型對誘捕效果的影響。研究表明，在早竹冠層的上層和中層懸掛誘捕器，能夠誘捕到更多的造癭害蟲，這可能與造癭害蟲趨向于在早竹冠層的中上層活動和尋找寄主有關(guān)[22]。本研究比較了不同類型誘捕器對誘捕量的影響，發(fā)現(xiàn)小船型誘捕器誘捕的造癭害蟲數(shù)量顯著多于三角形誘捕器（P＜0.05），而三角形誘捕器誘捕的造癭害蟲數(shù)量顯著多于桶型誘捕器（P＜0.05）、實蠅誘捕器（P＜0.05）和夜蛾誘捕器（P＜0.05）。因此，在后續(xù)的造癭害蟲大量誘殺時宜使用小船型誘捕器。

本研究對2種造癭害蟲的林間種群時序動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂的成蟲活動高峰期較接近，均在4月下旬到5月上旬之間，因此可以利用這一規(guī)律，合理安排懸掛誘捕器的時間，提高植物源誘控技術(shù)的防控效果。

4 結(jié)論

本研究采用林間生物測定法比較了7種揮發(fā)物對2種早竹造癭害蟲的引誘效果，發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯強(qiáng)烈地引誘剛竹泰廣肩小蜂，而低濃度的順-3-己烯-1-醇對竹泰廣肩小蜂具有很好的引誘效果。比較了不同類型的誘捕器和不同懸掛高度對誘捕效果的影響，監(jiān)測了2種早竹造癭害蟲林間的種群時序動態(tài)。研究結(jié)果表明，在4月下旬到5月上旬，使用水楊酸甲酯與順-3-己烯-1-醇30:1比例的混合物作為引誘劑，在早竹冠層的中層或上層懸掛小船型誘捕器，能夠誘捕到更多的剛竹泰廣肩小蜂和竹泰廣肩小蜂。研究結(jié)果為高效早竹造癭害蟲植物源誘控技術(shù)研發(fā)及早竹造癭害蟲的生態(tài)調(diào)控提供技術(shù)支撐。