葛根湯對(duì)寒濕凝滯型原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠的治療作用及其機(jī)理研究

劉志剛 張榮春 劉紅梅 王志鵬

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇南京210009）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）是婦女盆腔結(jié)構(gòu)正常情況下出現(xiàn)的月經(jīng)期疼痛，其特征是在月經(jīng)開始前或月經(jīng)開始時(shí)出現(xiàn)的盆腔痙攣性疼痛，通常持續(xù)1～3 d[1]。PD的發(fā)病率在年輕女性中約為40%～50%[2]。目前認(rèn)為前列腺素（prostaglandin，PG），尤其是前列腺素F2α（PGF2α），是PD發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。非甾體抗炎藥物（NSAIDs）常用來治療本病[1]，其作用機(jī)制即與抑制前列腺素的合成有關(guān)，但NSAIDs僅能暫時(shí)緩解疼痛，并沒有根治或預(yù)防效果，必須在疼痛開始前或開始時(shí)服藥才能有效緩解疼痛，需要長(zhǎng)期用藥[3]。這提示必須從根本上持久阻斷PGF2α的上游及/或下游通路，方能達(dá)到長(zhǎng)期緩解的目的。研究顯示，縮宮素（oxytocin，OT）[4]、血管升壓素（arginine vasopressin，AVP）[5]等均與PD的發(fā)病有關(guān)，腫瘤壞死因子α（TNF-α）也可以參與子宮內(nèi)膜PGF2α的調(diào)控[6]。

葛根湯是一首經(jīng)典名方，臨床主要用于治療風(fēng)寒外襲引起的感冒，“解肌散寒”為其主要功效。我們?cè)谂R床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，葛根湯治療寒濕凝滯型PD效果明顯，而且療效持久，甚至不再?gòu)?fù)發(fā)，說明該方可能從上游及/或下游機(jī)制持久地阻斷PGF2α，而不是單純地抑制PGF2α的合成。

目前研究PD的動(dòng)物模型比較缺乏，最常用的是利用雌激素序貫縮宮素的動(dòng)物模型，但該模型沒有模擬行經(jīng)樣改變。為此，我們采用小鼠子宮內(nèi)膜行經(jīng)樣模型復(fù)合水浸束縛應(yīng)激模型來模擬人類在寒冷應(yīng)激情況下出現(xiàn)的痛經(jīng)反應(yīng)，構(gòu)建了小鼠寒濕凝滯型PD模型，并對(duì)葛根湯的治療作用進(jìn)行了初步研究，這種類似于實(shí)際病理生理過程的動(dòng)物模型將有助于闡明PD的發(fā)病機(jī)制和藥物的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性未孕昆明種小鼠，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，8～12周齡，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。于恒溫（20～23 ℃），恒濕（45%～60%），12 h光照/黑暗交替循環(huán)中飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)方法通過倫理委員會(huì)審查，符合國(guó)際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會(huì)《關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識(shí)》要求。

1.2 藥品與試劑 葛根湯，按照組成藥物麻黃∶葛根∶芍藥∶桂枝∶甘草∶生姜∶大棗=1∶4∶3∶3∶2∶2∶4的劑量比例，藥物購(gòu)自南京傳統(tǒng)中醫(yī)門診部，將藥物以8倍量清水浸泡30 min，熱回流提取1 h后過濾，再加6倍水回流提取40 min，合并2次濾液后濃縮至每毫升約含生藥量1 g。根據(jù)既往研究結(jié)果，雖然葛根湯不同劑量均能抑制縮宮素復(fù)合寒冷刺激誘導(dǎo)的PD模型小鼠疼痛扭體反應(yīng)，但以臨床劑量（高劑量）組作用最為明顯[7]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇臨床劑量（14 g/kg體重）作為研究劑量。

布洛芬緩釋片（上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.3 g/片，產(chǎn)品批號(hào)170323），雌二醇（Sigma，E2758），孕酮（Sigma，V900699），米非司酮（Sigma，M8046），花生油（山東魯花集團(tuán)有限公司），縮宮素試劑盒（Enzo Life Sciences公司，ADI-901-153A-0001），PGF2α試 劑 盒（Enzo Life Sciences公司，ADI-901-069），AVP試劑盒（MitoSciences公司，xyB263Mu），TNF-α試 劑 盒（Enzo Life Sciences公司，ADI-900-047）。

1.3 主要儀器 分析天平（浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠），冷凍離心機(jī)（Sigma），Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan Gmbh公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥 小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、葛根湯組及陽(yáng)性對(duì)照組，最終各組均為6只。

小鼠子宮內(nèi)膜行經(jīng)樣模型的制備參照文獻(xiàn)[8]方法，小鼠在麻醉下摘除雙側(cè)卵巢，恢復(fù)2周以清除體內(nèi)激素后進(jìn)行下列操作：去勢(shì)小鼠在第1、2和3天皮下注射0.37 nmol雌二醇；第4～6天不給予任何處理；第7天將孕酮硅膠管埋植于小鼠背部皮下，同時(shí)0.16 nmol孕酮、0.02 nmol雌二醇皮下注射；第8、9天皮下注射18.3 nmol雌二醇，第9天注射2 h后，向小鼠雙側(cè)子宮角各注射20 μL花生油，向子宮腔內(nèi)注射40 μL花生油，以刺激子宮腔上皮啟動(dòng)蛻膜化信號(hào)途徑誘導(dǎo)蛻膜化；48 h后，即第11天，米非司酮（120 mg/kg）灌胃。造模時(shí)間從卵巢摘除2周后注射雌二醇開始計(jì)算。在造模第12天，即米非司酮處理后的24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，涂片置95%乙醇固定10 min后觀察紅細(xì)胞出現(xiàn)情況。如可見紅細(xì)胞，說明造模成功。如未見紅細(xì)胞，后每隔4 h進(jìn)行陰道涂片，直至見到紅細(xì)胞為止。

除空白對(duì)照組，其余各組小鼠在行經(jīng)模型誘導(dǎo)過程中同時(shí)完成以下操作：在去勢(shì)恢復(fù)2周后的第1～12天將小鼠置于束縛籠后放置（8±0.5）℃冷水水浴中，浸泡1 h，每日1次。

去勢(shì)恢復(fù)2周后的第1天開始，葛根湯組給予葛根湯14 g·kg-1·d-1灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予布洛芬0.12 g·kg-1·d-1灌胃，空白對(duì)照組和模型組給予等容積生理鹽水，各組給藥均持續(xù)12 d。

2.2 指標(biāo)觀察 造模第12天，陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將各組小鼠麻醉后，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，再分離取出子宮，進(jìn)行指標(biāo)觀察。

2.2.1 HE染色觀察小鼠子宮組織病理形態(tài) 取出子宮后用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察。主要觀察子宮組織血管分布及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.2.2 ELISA法檢測(cè)血清及子宮組織PGF2α、OT、TNF-α及AVP水平 各組小鼠取血后，常溫靜置30 min，離心半徑為8 cm，3 500 r/min，離心15 min，取血清，-70 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。分離出的子宮，剔除脂肪組織，用電子分析天平稱取子宮的質(zhì)量，以每克子宮組織加9倍量生理鹽水用勻漿機(jī)制備10%組織勻漿，離心半徑為8 cm，3 000 r/min，低溫離心10 min，分離出上清液，-70 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組小鼠血清和子宮組織中PGF2α、OT、TNF-α及AVP的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠子宮組織病理形態(tài)比較 子宮組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組較空白對(duì)照組血管偏少，間質(zhì)致密，炎性細(xì)胞增生、浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組較模型組血管更豐富，間質(zhì)疏松，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；葛根湯組較模型組血管更少，間質(zhì)緊密，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少，成纖維細(xì)胞增生減少。見圖1。

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜病理組織學(xué)變化（×100）

3.2 各組小鼠血清及子宮組織中PGF2α、OT、TNF-α、AVP含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清和子宮組織PGF2α、OT、TNF-α和AVP水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清及子宮組織PGF2α、OT、TNF-α和AVP水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01）；葛根湯組小鼠血清及子宮組織PGF2α、TNF-α和AVP水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），血清OT水平明顯降低（P<0.01）。葛根湯組小鼠血清PGF2α、OT及TNF-α水平，子宮組織OT水平明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05，P<0.01）。見表1、表2。

表1 各組小鼠血清PGF2α、OT、TNF-α和AVP含量比較（）

表1 各組小鼠血清PGF2α、OT、TNF-α和AVP含量比較（）

注： 與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

血管升壓素（AVP，ng/mL）空白對(duì)照組 6 13.70±0.91 131.94±2.93 1.34±0.04 8.72±0.46模型組 6 17.52±1.26** 146.12±4.92** 1.42±0.04* 12.67±1.06**陽(yáng)性對(duì)照組 6 11.86±1.72## 118.12±7.68## 1.20±0.10## 9.32±0.84##葛根湯組 6 15.48±0.65#△ 134.65±5.94##△△ 1.30±0.02##△△ 10.43±1.96##組別 動(dòng)物數(shù)/只 前列腺素F2α（PGF2α，ng/mL）縮宮素（OT，pg/mL）腫瘤壞死因子α（TNF-α，ng/mL）

表2 各組小鼠子宮組織PGF2α、OT、TNF-α和AVP含量比較（）

表2 各組小鼠子宮組織PGF2α、OT、TNF-α和AVP含量比較（）

注： 與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

血管升壓素（AVP，pg/mg）空白對(duì)照組 6 103.91±7.66 93.81±3.65 20.84±3.49 7.55±2.05模型組 6 115.75±8.31** 102.47±8.50* 25.40±3.48** 12.94±2.08**陽(yáng)性對(duì)照組 6 106.08±4.36# 87.40±6.00## 18.64±2.72## 9.30±0.88##葛根湯組 6 105.72±6.69# 95.28±5.81△ 21.15±2.60# 10.41±0.95##組別 動(dòng)物數(shù)/只 前列腺素F2α（PGF2α，pg/mg）縮宮素（OT，pg/mg）腫瘤壞死因子α（TNF-α，pg/mg）

4 討論

雖然目前已明確地認(rèn)為PG，尤其是PGF2α異常升高，在PD的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是從抑制前列腺素合成的一線治療藥物NSAIDs僅能暫時(shí)緩解疼痛，不能預(yù)防痛經(jīng)的反復(fù)發(fā)作來看，推測(cè)降低PGF2α周期性異常升高是“治愈”PD的途經(jīng)之一，而明確PD患者子宮內(nèi)膜PGF2α異常升高的機(jī)制可能是闡明該病發(fā)病機(jī)制的重要途徑。PGF2α的升高不僅是PD發(fā)生的關(guān)鍵因素，在月經(jīng)周期形成過程中也具有非常重要的作用。在生理情況下，子宮內(nèi)膜PGF2α的分泌是月經(jīng)周期中導(dǎo)致黃體退化的始動(dòng)因素[9]，黃體退化過程中PGF2α的異常調(diào)控可能是PD發(fā)病的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，OT、TNF-α參與黃體退化過程中PGF2α的調(diào)控[6，10]。OT在非孕子宮是重要的PGF2α分泌信號(hào)[11]。在黃體溶解前，卵巢的TNF-α溶基因表達(dá)及其釋放出現(xiàn)急劇增加[12]。因此，OT與TNF-α均與月經(jīng)期子宮內(nèi)膜PGF2α的表達(dá)密切相關(guān)。在應(yīng)激條件下，這些活性物質(zhì)的增加可能會(huì)導(dǎo)致月經(jīng)期子宮內(nèi)膜PGF2α分泌的異常增加，從而引發(fā)痛經(jīng)。盡管目前沒有發(fā)現(xiàn)AVP對(duì)黃體退化及/或PGF2α生成有明確影響，但AVP與PD的關(guān)系十分密切[13]，因此本實(shí)驗(yàn)將其也作為觀察對(duì)象。

葛根湯出自張仲景的《傷寒論》，由葛根、麻黃、桂枝、芍藥、甘草、生姜、大棗等7味藥物組成。實(shí)際上，該方是由桂枝湯加葛根、麻黃而成。桂枝湯可以解肌發(fā)表、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，用于外感風(fēng)寒表虛之證，而加入麻黃增強(qiáng)散寒解表作用，葛根增強(qiáng)解肌散寒功效，使處方轉(zhuǎn)而治療外感風(fēng)寒表實(shí)證，其突出特點(diǎn)是“散寒”“解肌”，因而臨床廣泛用于肌肉張力異常及痙攣性疾病，如頸椎病，尤其對(duì)因感受風(fēng)寒誘發(fā)或加重者療效顯著。PD在中醫(yī)臨床上以實(shí)證居多，而實(shí)證中又以寒濕凝滯證為主[14]，臨床表現(xiàn)為極痛的患者辨證多屬寒濕凝滯證或氣滯血瘀證。而寒濕凝滯型PD的病機(jī)與葛根湯功效主治十分契合，因此療效顯著。葛根湯的作用機(jī)制顯然與NSAIDs不同，該方在停藥后數(shù)月，甚至數(shù)年都有持續(xù)的作用，說明葛根湯能夠糾正PD發(fā)病的始動(dòng)因素，而不是單純地暫時(shí)抑制PGF2α的合成。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，葛根湯對(duì)縮宮素復(fù)合寒冷刺激誘導(dǎo)的寒濕凝滯型原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型具有顯著治療作用[7，15]，但葛根湯具有長(zhǎng)期效應(yīng)的機(jī)制還有待研究。

本研究采用小鼠子宮內(nèi)膜行經(jīng)樣模型與水浸束縛應(yīng)激的復(fù)合造模手段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后小鼠陰道涂片有紅細(xì)胞出現(xiàn)，子宮組織病理學(xué)觀察顯示模型組較空白對(duì)照組炎性細(xì)胞增多，血清及子宮組織PGF2α明顯增高。這些發(fā)現(xiàn)說明本實(shí)驗(yàn)通過小鼠行經(jīng)模型復(fù)合冷水水浸束縛手段模擬了PD患者在月經(jīng)期血液及子宮組織中PGF2α異常升高的病理生理特征。同時(shí)，該模型采用冷水水浸束縛的實(shí)驗(yàn)方法也符合寒濕凝滯型PD病機(jī)特征。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，寒主收引，其性凝滯，導(dǎo)致氣滯血瘀，可以引發(fā)疼痛等諸多疾病。流行病學(xué)研究表明，貪涼飲冷、受涼等是PD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[16]。

本研究結(jié)果表明，模型組小鼠血清及子宮組織中OT、AVP及TNF-α較空白對(duì)照組明顯增高，說明這些指標(biāo)水平在寒冷刺激過程中均出現(xiàn)增高并且可能導(dǎo)致PGF2α異常增加。葛根湯在顯著降低小鼠PGF2α水平的同時(shí)，對(duì)OT、AVP及TNF-α水平的升高也有緩解作用，說明葛根湯可能通過調(diào)節(jié)這些活性物質(zhì)的水平，抑制PGF2α的異常分泌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于理解葛根湯的治療作用，但還需要更深入研究明確其作用機(jī)制。進(jìn)一步的研究可以分為兩個(gè)方向：一是從細(xì)胞、分子水平對(duì)子宮內(nèi)膜PGF2α異常升高的上游機(jī)制進(jìn)行研究，諸如OT、TNF-α、AVP與PGF2α分泌的關(guān)系；二是從細(xì)胞、分子水平就PGF2α對(duì)子宮組織作用的下游分子機(jī)制（如PGF2α受體表達(dá)及其影響因素）進(jìn)行深入研究。