腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155、XpertMTB/RIF水平在結(jié)核性腦膜炎診斷中的價(jià)值

孫萬里 魯增輝 蔡華鋒 周倩倩 馬苑 王月

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種常見非化膿性炎癥性疾病，由結(jié)核分枝桿菌感染神經(jīng)系統(tǒng)所致，TBM發(fā)病率占全身結(jié)核病的6%，是肺外結(jié)核中最為嚴(yán)重的一類，致殘率、致死率高，嚴(yán)重危害患者生命安全[1]。TBM早期癥狀不明顯，腦脊液常規(guī)、生化改變不典型，易造成誤診和漏診[2]。顱腦CT、MRI檢查特異性低，涂片檢查耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低且漏診率高[3]。因此尋找敏感、特異指標(biāo)對(duì)TBM早期診斷非常重要，對(duì)及時(shí)治療、改善患者預(yù)后意義重大。腺苷酸脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)是嘌呤代謝中重要酶類，與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有關(guān)，結(jié)核分枝桿菌感染后，可引發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂，釋放ADA[4]。γ-干擾素(interferonγ，IFN-γ)是免疫反應(yīng)中關(guān)鍵細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在TBM免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。近來體液中微小RNA(microRNA，miRNA)成為一種新型診斷標(biāo)志物，有研究報(bào)道m(xù)ir-155在結(jié)合分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中其重要作用[6]。結(jié)核性腦膜炎/利福平耐藥基因檢測(cè)(XpertMTB/RIF)是由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)的一種新型TBM及利福平耐藥診斷技術(shù)，目前在臨床上備受關(guān)注[7]。因此本研究擬探究腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155聯(lián)合XpertMTB/RIF檢測(cè)在結(jié)核性腦膜炎診斷中的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月本院收治的200例TBM患者為觀察組，男103例，女97例；年齡18～75歲，平均年齡(42.75±11.58)歲。另取同期在本院進(jìn)行腦脊液檢查并經(jīng)組織學(xué)、影像學(xué)技術(shù)確診的非中樞系統(tǒng)疾病患者200例為對(duì)照組，男105例，女95例；年齡19～73歲，平均年齡(41.64±10.95)歲。2組患者性別比、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有樣品采集及資料調(diào)查取得患者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)，本研究經(jīng)過本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②臨床資料完整；③自愿配合調(diào)查研究。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌、真菌、病毒等引起中樞系統(tǒng)感染者；②患有惡性腫瘤者；③肝、腎等重要臟器功能障礙者；④臨床資料不全者。

1.3 主要試劑及儀器 Trizol試劑(貨號(hào)：R0016，上海碧云天)； PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(編號(hào)：RR037A，TaKaRa)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(編號(hào)：6210A，TaKaRa)；人ADA ELISA試劑盒(貨號(hào)：貨號(hào) PA1-27246，美國(guó)Invitrogen)人IFN-γELISA試劑盒(貨號(hào)：PT518，上海碧云天)；引物由廣州銳博生物工程有限公司合成；紫外分光光度計(jì)(美國(guó) Thermo Fisher公司)、RT-qPCR儀7500(美國(guó)Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 腦脊液采集:無菌條件下，對(duì)受試者行腰椎穿刺，取腦脊液3 ml，3 000 r/min，有效離心半徑10 cm，離心10 min，置于-80℃保存待檢。

1.4.2 腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查:采用Olympus AV640 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)腦脊液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例。

1.4.3 腦脊液生化指標(biāo)檢查:采用FCS IV型微型腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀器(Thermo Fisher，美國(guó))檢查腦脊液中糖、氯化物及蛋白質(zhì)含量。

1.4.4 腦脊液ADA、IFN-γ水平檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)腦脊液ADA、IFN-γ水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 腦脊液mir-155水平檢測(cè):采用Trizol提取腦脊液總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)mir-155表達(dá)水平。RT-qPCR采用20 μl反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl ，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)采用兩步法，條件設(shè)置為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。mir-155上游引物(5’→3’)：ACACTCCAGCTGGGCTCCTACACATATT，mir-155下游引物(5’→3’)：CTCAACTGGTCGTGGA。內(nèi)參U6上游引物(5’→3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，U6下游引物(5’→3’)：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCT法對(duì)腦脊液中mir-155的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 2組患者腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者腦脊液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例顯著增加，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果比較

2.2 2組患者腦脊液生化指標(biāo)檢查結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者腦脊液中糖、氯化物濃度顯著降低，蛋白質(zhì)濃度顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者腦脊液生化指標(biāo)檢查結(jié)果比較

2.3 2組患者腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比較

2.4 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平單獨(dú)檢測(cè)及XpertMTB/RIF檢測(cè)對(duì)TBM診斷價(jià)值比較 分別以腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平為檢測(cè)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平診斷TBM的AUC分別為0.824、0.827、0.785，靈敏度分別為81.00%、90.50%、74.00%，特異度分別為86.00%、77.00%、70.00%。以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，四格表分析顯示，XpertMTB/RIF檢出TBM的靈敏度為57.00%，特異度為91.00%。見表4，圖1。

圖1 ROC曲線腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平對(duì)TBM的診斷價(jià)值

表4 四格表分析XpertMTB/RIF對(duì)TBM的診斷價(jià)值 例

2.5 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF檢測(cè)對(duì)TBM診斷價(jià)值分析 將腦脊液ADA或IFN-γ或mir-155或XpertMTB/RIF檢測(cè)TBM陽(yáng)性規(guī)定為聯(lián)合診斷陽(yáng)性。腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF診斷TBM靈敏度為93.00%，特異度為91.00%。見表5。

表5 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155聯(lián)合XpertMTB/RIF檢出TBM的四格表 例

3 討論

生理情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在血-腦脊液屏障，腦脊液被封閉在蛛網(wǎng)膜下腔，機(jī)體血液中蛋白質(zhì)、糖及氯化物等物質(zhì)可選擇性透過血-腦脊液屏障進(jìn)入腦脊液[9]。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌時(shí)，腦膜、脈絡(luò)叢和室管膜會(huì)發(fā)生炎性反應(yīng)，造成腦脊液生成增多，蛛網(wǎng)膜顆粒吸收下降，血-腦脊液屏障受損，通透性增加，血液中蛋白進(jìn)入腦脊液增多，糖代謝發(fā)生紊亂，腦底處破裂結(jié)核結(jié)節(jié)周圍包含大量多核型白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等物質(zhì)的滲出物向蛛網(wǎng)膜下腔擴(kuò)散[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBM患者腦脊液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例顯著增加，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例顯著減少，提示TBM患者存在白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、蛋白質(zhì)顯著增多，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、糖及氯化物減少癥狀，符合TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)。

機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，在巨噬細(xì)胞抗原提呈作用下，通過T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放IFN-γ，IL-2等大量淋巴因子，其中IFN-γ在結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)中起重要作用[2]。張燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TBM患者腦脊液中IFN-γ水平顯著增加。吳長(zhǎng)靜[2]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染患者誘導(dǎo)T細(xì)胞IFN-γ釋放反應(yīng)，導(dǎo)致腦脊液IFN-γ水平顯著升高。ADA是腺嘌呤核苷酸代謝關(guān)鍵酶，可催化腺苷生成肌苷，經(jīng)尿酸排出體外。結(jié)核分枝桿菌感染突破血-腦脊液屏障后，刺激中樞神經(jīng)局部免疫系統(tǒng)T細(xì)胞增殖、分化，可導(dǎo)致腦脊液中ADA活性升高[12]。湯海燕等[9]研究報(bào)道，結(jié)合分枝桿菌感染可引起腦脊液中ADA水平增加。mir-155位于非編碼轉(zhuǎn)錄體bic外顯子，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化、參與炎癥及免疫應(yīng)答反應(yīng)[13,14]。柴璐璐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p在TBM患者腦血漿中表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBM患者腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均顯著高于對(duì)照組。綜合以上研究及本研究結(jié)果提示腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155可能是TBM相關(guān)敏感指標(biāo)，TBM患者免疫應(yīng)答反應(yīng)中T細(xì)胞增殖分化可能導(dǎo)致腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平升高，但對(duì)TBM的診斷價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

王永峰等[15]研究報(bào)道，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腦脊液ADA水平可作為評(píng)價(jià)TBM患者預(yù)后質(zhì)量的重要指標(biāo)。楊澤偉等[3]研究報(bào)道，腦脊液ADA、IFN-γ對(duì)TBM有一定診斷價(jià)值。Wu等[16]研究報(bào)道，mir-155在TBM患者腦脊液中表達(dá)水平升高，有潛力成為TBM敏感診斷標(biāo)志。XpertMTB/RIF是一種新型TBM診斷技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)TBM和利福平耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，XpertMTB/RIF對(duì)痰標(biāo)本具有較高的靈敏度和特異度，對(duì)肺結(jié)核診斷價(jià)值較高，但對(duì)肺外結(jié)核診斷價(jià)值研究較少[17,18]。本研究分析發(fā)現(xiàn)腦脊液ADA水平診斷TBM靈敏度低，IFN-γ診斷TBM特異度低、mir-155水平及XpertMTB/RIF檢測(cè)診斷TBM靈敏度和特異度均不佳。因此本研究進(jìn)一步對(duì)腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF對(duì)TBM的診斷價(jià)值進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈敏度為93.00%，特異度為91.00%，顯著高于單獨(dú)檢測(cè)的靈敏度及特異度，提示腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF檢測(cè)可提高對(duì)TBM診斷的靈敏度和特異度，對(duì)TBM診斷有一定臨床價(jià)值。

綜上所述，腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF檢測(cè)可提高對(duì)TBM診斷的靈敏度和特異度，對(duì)TBM診斷有一定臨床價(jià)值。但由于本研究樣本量少，結(jié)果可能具有局限性，腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯(lián)合XpertMTB/RIF檢測(cè)是否可應(yīng)用于TBM臨床診斷，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。