miR-17-5p在乳腺癌組織中的表達及與預(yù)后的相關(guān)性研究

鄭麗華 王昕儀 趙亞恒 齊一睿 劉運江 劉鵬 徐曌

無論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，乳腺癌是最常見威脅女性生存的癌癥之一，乳腺癌與多種信號通路，基因，表觀遺傳，分子學(xué)的改變息息相關(guān)。隨著診斷，手術(shù)和內(nèi)科治療的發(fā)展，乳腺癌患者預(yù)后已經(jīng)得到改善。乳腺癌預(yù)后標志物缺乏，乳腺癌治療的不合適是造成治療效果差和轉(zhuǎn)移的重要原因，因此我仍需要一些新的能夠預(yù)示預(yù)后、診斷和治療效果的標志物[1,2]。MicroRNA(miRNA)是由20～24個核苷酸組成的非編碼小RNA， 是多種生物的主要調(diào)控分子，能夠調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等功能[3-6]。很多證據(jù)都已表明，miRNA可以充當(dāng)癌基因或抑癌基因，并且在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，例如癌癥耐藥性，癌細胞增殖和癌細胞轉(zhuǎn)移。癌癥中一個通常上調(diào)miRNA簇是 miR-17-92 簇，miR-17-92 簇的主要效應(yīng)miRNA是 miR-17-5p (也稱為 miR-17)，多種實體癌中表達上升。miR-17-5p 也是該簇中與癌癥相關(guān)的研究最多的 miRNA 之一。許多證據(jù)表明，miR-17-92 簇可作為乳腺癌的一類新型癌基因或抑癌基因，在乳腺癌的腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起作用。與正常組織相比，已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了miR-17-5p表達更高，例如大腸癌，胃癌，肝細胞癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，基底細胞癌，胰腺癌，乳腺癌，骨肉瘤等[7-14]。miRNA具有穩(wěn)定性，在可以在血清，血漿，尿液中檢測到，穩(wěn)定表達和易于獲得的性質(zhì)為其作為無創(chuàng)性標記物提供了可能。我們研究miR-17-5p在正常乳腺組織幾乳腺癌中的表達情況，并對乳腺癌患者進行隨訪。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月至2019年1月就診于河北醫(yī)科大第四醫(yī)院乳腺中心576例浸潤性乳腺癌患者，所有患者經(jīng)病理證實。收集患者的病理資料及臨床資料。對576例乳腺癌患者進行術(shù)后分期：Ⅰ期142例，Ⅱ期352例，Ⅲ期63例，Ⅳ期19例。

1.2 qRT-PCR RNA的提取 將取出的新鮮組織保存在液氮中，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄：使用RNA模板與RT引物，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄RNA，根據(jù)試劑盒說明測定miR-17-5p，并計算其相對表達量。

1.3 隨訪情況 采用門診，電話和病歷查閱方式對576例患者進行隨訪，以病例確診時間開始計算生存時間，隨訪至2019年8月終止事件為患者死亡。隨訪時間為3～127個月，中位隨訪時間為70個月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料采用χ2檢驗和Fisher’s確切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，通過Log-Rank法行生存率差別檢驗，并采用 Cox比例回歸風(fēng)險模型進行多因素生存分析。運用易侕軟件建立患者生存率模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 將miR-17-5p分為2組后患者人群分析 用X-tile軟件將miRNA-17分為≥1 021與<1 021組。當(dāng)當(dāng)miR-17-5p高表達時，存活時間為(60.4±7.8)月，當(dāng)miR-17-5p低表達時，存活時間為(75.2±7.0)月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。說明的當(dāng)miR-17-5p降低時，存活時間升高。見表1。

表1 將miR-17-5p分為2組后患者人群分析 例(%)

2.2 乳腺癌患者單因素分析 單因素分析，根據(jù)單因素分析可知，年齡，HER-2狀態(tài)，是否絕經(jīng)與miR-17-5p是均與預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 乳腺癌患者單因素分析 例(%)

2.3 乳腺癌患者的多因素分析 多個回歸方程分析可得，miR-17-5p是影響OS的獨立預(yù)后因素(P<0.05)。見表3。

表3 乳腺癌患者的多因素分析

2.4 乳腺癌組織與良性乳腺組織miR-17-5p比較 乳腺癌組織和正常組織的中miR-17-5p的表達，可見乳腺癌組織miR-17-5p的相對表達量高于其在正常組織中的相對表達量(P=0.012)。見表4。

表4 乳腺癌組織與良性乳腺組織miR-17-5p比較

2.5 生存分析示 K-M曲線顯示，相較于癌組織中miR-17≥1 021組，癌組織中miR-17<1 021組的患者生存率更高。見圖1。

圖1 miR-17-5p高表達與低表達的生存曲線

3 討論

乳腺癌是國內(nèi)外女性最常見腫瘤之一，近年來隨著診療技術(shù)的進步乳腺癌患者預(yù)后得到改善，但仍有部分乳腺癌患者預(yù)后差，所以選擇合適的指標來預(yù)示預(yù)后、診斷和治療效果的標志物具有重要意義。在過去的十年中，已證實 miRNA 可以調(diào)節(jié)正常細胞中的多個關(guān)鍵細胞過程，包括細胞生長，細胞分化，細胞周期和細胞死亡。在癌癥中miRNA 可以作為癌基因或抑癌基因來調(diào)節(jié)多種癌癥，例如癌癥耐藥性，癌

細胞增殖和癌細胞轉(zhuǎn)移。所有miRNA的成熟過程均始于細胞核[15,16]。在細胞核中，RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄基因形成初級miRNA，該初級產(chǎn)物部分堿基互補配對，不能配對部分形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后，Drosha及其輔助因子DGCR8作用下形成次級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)夾pre-miRNA[17]。pre-miRNA通過輸出蛋白5轉(zhuǎn)運復(fù)合物的作用下輸出到細胞質(zhì)，被Dicer切開莖環(huán)的一段形成雙鏈miRNA。雙鏈miRNA的引導(dǎo)鏈在其5’端顯示弱氫鍵，有利于其與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物 (RISC)中的Ago2結(jié)合，該引導(dǎo)鏈被認為是具有活性的成熟miRNA。與之相對的是過客鏈，過客鏈被認為是沒有活性的，從而發(fā)生解離的和退化[18]。成熟miRNA通過Watson-Crick堿基配對特異性識別mRNA的靶區(qū)域，配對一般發(fā)生在成熟miRNA種子區(qū)域(miRNA引導(dǎo)鏈5’端的2至8位核苷酸)和靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)。成熟miRNA與相關(guān)蛋白結(jié)合形成miRISC沉默復(fù)合物來發(fā)揮作用[19]。在RISC介導(dǎo)下，成熟miRNA與mRNA的3’UTR之間的完美互補，從而導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或降解[20,21]。此過程通常在細胞質(zhì)中進行[22]。平均每個miRNA可以靶向識別數(shù)百種mRNA[23]。因此針對某一種miRNA寡核苷酸療法可能會影響其他的基因。miRNA具有穩(wěn)定性，在可以在血清，血漿，尿液中檢測到，穩(wěn)定表達和易于獲得的性質(zhì)為其作為無創(chuàng)性標記物提供了可能。

除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑外，miRNA也被認為是轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。完整的表達相關(guān)性分析和預(yù)測的miRNA-mRNA相互作用確定了3個miRNA家族成員(miR-17，miR-200和miR-96)作為基底樣腫瘤中前轉(zhuǎn)移基因的阻遏物。與已報道抑制EMT的miR-200和miR-96家族成員不同，據(jù)報道，由MIR17HG編碼的miRNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移進展中的作用令人爭議，在癌癥中廣泛觀察到異常表達的miRNAs，表明其致癌或抑制作用[15]。

miR17-5p，也稱為miR-17和miR-17-92簇復(fù)合物的主要效應(yīng)子，已被接受為固體癌miRNA的生物標志物。最近的數(shù)據(jù)表明，miR-230 17-5p通過PI3K/Akt/mTOR途徑的231調(diào)控參與腫瘤的增殖。在三陰性乳腺癌中也觀察到miR-17-5p的過表達。 miRNA可能在抑制抑癌基因的核糖體翻譯中發(fā)揮作用。先前在高侵襲性MDA-MB-231乳腺癌細胞進行的研究表明，miR-17-5p通過 HBP1/Wnt/b-catenin途徑參與乳腺癌的侵襲和遷移。miR-17-5p可能通過抑制E2F1的增殖活性來作為腫瘤抑制因子，它同時具有癌基因和抑癌作用。另外，通過BIM，p21和PTEN，miR-17-5p也被認為是關(guān)鍵的致癌性fac-分子。有研究表明ETV1是miR-17-5p的直接靶點[21]。鑒于觀察到與ETV1相反，在TNBC細胞系和臨床腫瘤組織中miR-17-5p被下調(diào)，推測miR-17-5p的上調(diào)將通過靶向靶向抑制三陰性乳腺癌細胞的致癌活性。ETV1和miR-17-5p異?？赡芘cTNBC患者的預(yù)后有關(guān)。ETV1通過激活MMP，COX-2和VEGF表達來促進腫瘤發(fā)生活性，研究表明，ETV1在TNBC中起癌基因的作用，并且可能是患者的獨立，不良預(yù)后指標[17]。高表達的miR-17通過抑制ETV1蛋白的翻譯增強黑色素瘤細胞的運動性和遷移，這可能支持轉(zhuǎn)移的發(fā)展。但是，GIST中的miR-水平明顯較低。 GIST細胞系中miR-17的上調(diào)通過降解ETV1 mRNA抑制細胞增殖，這可能抑制腫瘤的進展。這些結(jié)果表明，即使一個miRNA靶向相同的基因，它也可能以依賴細胞類型和環(huán)境的方式起癌基因或抑癌基因的作用。研究檢測到miR-17-5p和ETV1在TNBC細胞系和腫瘤組織中的反向表達模式。增強miR-17-5p在TNBC細胞系中的表達，不僅顯著降低ETV1的表達，而且抑制細胞增殖，遷移和侵襲，這可能會抑制TNBC的發(fā)育。此外，在存在miR-17-5p的情況下挽救ETV1表達可顯著恢復(fù)細胞表型。這些結(jié)果表明，miR-17-5p可能通過調(diào)節(jié)ETV1表達來影響TNBC的行為。使用成熟的斑馬魚轉(zhuǎn)移模型的體內(nèi)試驗進一步支持了這一點。結(jié)果表明，可能存在一個信號通路，即c-Myc/p53-miR-17-5p-ETV1-MMP，COX-2和VEGF,在TNBC發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，COP1的過表達可顯著降低ETV1的水平，并改變TNBC細胞表型。MYC是MIR17HG的主要轉(zhuǎn)錄激活因子。這與MIR17HG和MYC的表達水平在乳腺腫瘤中緊密相關(guān)的發(fā)現(xiàn)一致。由于MYC普遍增強了給定細胞中所有活性基因的轉(zhuǎn)錄，因此MYC下調(diào)的基因可能是MYC激活的轉(zhuǎn)錄阻遏物或miRNA的靶標。有趣的是，有研究發(fā)現(xiàn)MYC的表達與含有MIR17HG-miRNA靶位點的促轉(zhuǎn)移基因的表達呈負相關(guān)。有研究提出MIR17HG-miRNA通過靶向參與EMT的基因/途徑在維持MYC驅(qū)動的增殖狀態(tài)中發(fā)揮作用，該過程可以通過TGFB激活被多種壓力激活，并與MYC失活和細胞生長相關(guān)。這與MYC抑制細胞侵襲性遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的先前觀察一致。

在本研究表明癌組織miR-17-5p相對表達量高于正常乳腺組織的表達量，在乳腺癌患者中生存分析顯示當(dāng)miR-17-5p降低時，OS升高，多因素分析顯示miR-17-5p是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，本研究結(jié)果符合多數(shù)研究。Lee等[24]的研究表明，miR-17-5p促進轉(zhuǎn)移性癌細胞的遷移和侵襲，靶向抑制化生長因子-β(TGF-β)信號通路促進乳腺導(dǎo)管原位癌向乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的轉(zhuǎn)化。值得一提的是TGF-β在乳腺癌的腫瘤發(fā)生中具有悖論，它在良性乳腺上皮中起到抑癌作用，但在乳腺組織中轉(zhuǎn)化為惡性組織時卻起到促進腫瘤轉(zhuǎn)化的功能[24]，可能正是TGF-β信號通路的這種復(fù)雜性，造成某些靶向抑制TGF-β信號通路，卻得到相反結(jié)果。Li等[25]的研究表明miR-17-5p在高侵襲性MDA-MB-231乳腺癌細胞中高表達，而在低侵襲性MCF-7乳腺癌細胞中不高。miR-17-5p 在 MCF-7細胞中的過表達使它們具有侵襲和遷移能力，miR-17-5p 的下調(diào)抑制了MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。這一過程可能通過靶向 HBP1/β-catenin 途徑，miR-17-5p通過抑制HBP1而導(dǎo)致Wnt/β-catenin 活化，BP1通過抑制LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子來抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)。Wnt信號傳導(dǎo)中的基本事件是 β-catenin穩(wěn)定存在，由此產(chǎn)生β-catenin積累，從而增加了細胞核中β-catenin含量，于是β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合并激活某些基因，例如 Cyclin D1，c-Myc，SDF1 和 Twist，進一步促進腫瘤細胞的增殖、侵襲。 值得一提的是，HBP1的功能喪失已被證明與浸潤性乳腺有關(guān)[26]。因此，HBP可能在乳腺癌進展中起重要作用，并且可能是預(yù)防和治療乳腺癌的潛在靶點。除此之外，miR-17-5p還可以調(diào)節(jié) p21，PTEN和BIM的表達，起關(guān)鍵的致癌因子的作用。Li等[25]的研究證明miR-17-5p抑制抑癌基因的mRNA，例如PDCD4(程序性細胞死亡4)和PTEN(磷酸酶和張力蛋白同源物)，因此，miR-17-5p被認為是致癌的miRNA[27]。腫瘤抑制蛋白PDCD4和PTEN通常在TNBC中被抑制，與miRNA水平升高相關(guān)[28]。

除此之外，miR-17-5p可以廣泛參與炎癥、細胞脂化等進程。miR-17-5p 的異位表達可以通過抑制 PPAR-α 表達來促進脂肪肝的發(fā)展，誘導(dǎo)脂肪變性和肝硬化[29]。可以在很早的時候甚至在肝硬化階段被用作 HCV 陽性 HCC 的新型非侵入性生物標志物[30]。子宮內(nèi)膜異位癥的女性血漿 miR-17-5p呈現(xiàn)下調(diào)趨勢[31]。

總之，miR-17廣泛參與細胞增殖，分化的過程，并且在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，本研究表明mir-17-5p相較于正常組織，在乳腺癌組織中高表達，且表達越高，生存時間越短，發(fā)揮促癌作用，但其表達促癌或抑癌作用根據(jù)其靶向的mRNA不同而發(fā)揮不同作用，至今Mir-17直接靶向的下游蛋白探索仍不夠全面，需要我們進一步發(fā)掘。