BMP-2修飾摻鍶磷酸鈣修復(fù)去卵巢大鼠股骨干骺端骨缺損實(shí)驗(yàn)研究

周茂生，胡旭峰，謝加兵，吳興凈，張 欣

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨密度和骨量減少為特征的疾病，在美國、歐洲和日本危害7500萬人，每年全世界超過890萬人出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折[1]。一旦發(fā)生骨折或缺損時(shí)超過一定體積，就需要骨移植手術(shù)進(jìn)行骨修復(fù)。自體骨移植是目前廣泛接受的治療骨折和骨缺損最常用方法之一[2]。由于自體骨移植供區(qū)有限，同種異體骨移植可能出現(xiàn)排斥反應(yīng)，因此人工合成材料備受關(guān)注[3]。磷酸鈣(calcium phosphate,CPC)具有良好的生物相容性、生物降解性和骨傳導(dǎo)性，是目前應(yīng)用最廣泛的骨再生材料之一[3-5]。先前的研究表明，CPC中鍶(Sr)的存在可促進(jìn)生物材料的吸收性和隨后的骨形成[6]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)由于其優(yōu)異的骨誘導(dǎo)能力而被廣泛用于促進(jìn)骨修復(fù)；BMP-2可以通過收集骨祖細(xì)胞并誘導(dǎo)成骨分化來促進(jìn)骨修復(fù)[7]。由于臨床使用中BMP-2局部劑量較高，會(huì)出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，如異位骨化與椎管狹窄導(dǎo)致脊髓壓迫等[8]。本研究將BMP-2復(fù)合Sr修飾CPC對(duì)比研究同等劑量BMP-2復(fù)合CPC修復(fù)骨質(zhì)疏松骨缺損治療效果，驗(yàn)證新復(fù)合材料治療骨質(zhì)疏松骨缺損的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠納入本研究，在環(huán)境溫度(22±1)℃和相對(duì)濕度(45±50)%的條件下隨意飼養(yǎng)，水和食物可以自由接觸。自動(dòng)控制明暗周期約12 h。所有程序均經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料制備 CPC和Sr/CPC的制備使用等摩爾TTCP[Ca4(PO4)2O]和DCPA(CaHPO4)制備CPC前體粉末。隨后按照1 mg粉末加入0.2 mg BMP-2，固化劑為 0.5 mol/L 稀磷酸，在室溫、100% 相對(duì)濕度條件下分別固化 24 h，制成直徑2.5 mm、高度5 mm樣品(固化時(shí)粉、液質(zhì)量比為2∶1)。分別為CPC、BMP-2/Sr/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)和BMP-2/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)，具體材料制備步驟參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 模型建立 雙側(cè)去卵巢手術(shù)后12周，將大鼠隨機(jī)分為： 假手術(shù)組(Sham，n=5)和卵巢切除模型組(OVX，n=45)。模型建立12周后，OVX大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組) 、CPC組(CPC組)、BMP-2/CPC組(BCPC組)和BMP-2/Sr/CPC組(BSCPC組),隨后在大鼠股骨髁制作直徑2.5 mm、長5 mm圓形缺損。通過腹膜內(nèi)注射4 mL/kg水合氯醛麻醉大鼠。在雙側(cè)股骨髁外側(cè)進(jìn)行皮膚切口，并進(jìn)行股四頭肌鈍性解剖以暴露股骨干骺端。然后制作一個(gè)直徑2.5 mm圓形缺損。分別植入通過注入鹽水沖洗孔，以從空腔中去除骨碎片，CPC組、BCPC組和BSCPC組分別植入相對(duì)應(yīng)的材料。隨后使用縫線逐層縫合筋膜和皮膚。

1.4 樣本的收集和檢測 各組大鼠在缺損術(shù)后8周用過量水合氯醛將大鼠安樂死。收集雙側(cè)股骨，清除黏附的軟組織，將右股骨用冰浸在鹽水中的紗布包裹。

使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)將股骨樣品脫鈣8周，將脫鈣的骨樣品包埋在石蠟中并使用蘇木素(Hematoxylin)和伊紅(Eosin)染色后用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)檢查組織切片。

使用微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT； Y.Cheetah； YXLON International GmbH，德國)評(píng)估骨缺損愈合的影響。使用VG Studio 2.1 V軟件(版本2.6)對(duì)股骨進(jìn)行掃描，并對(duì)18 μm(像素)處的管電壓為80 kV且電流為60 μA的X射線進(jìn)行成像。在180°的角度范圍內(nèi)總共獲取了450個(gè)投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的錐束重建軟件重建圖像切片。定義了標(biāo)準(zhǔn)化的三維關(guān)注區(qū)域，其圓柱形狀為3 mm長和2.5 mm直徑。獲得骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)來自于Micro-CT的3D渲染圖像。

左側(cè)股骨缺損區(qū)域在冰冷裂解緩沖液中勻漿。蛋白濃度用BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Scientific)定量。用SDS-PAGE在812%聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜。免疫印跡與一抗包括Notch(Ab15251)和RUNX-2(Ab23981)；CBF 1(Ab15345)和Jagged 1(Ab15341)。在4℃下孵育過夜，然后與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL-plus試劑對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行可視化，并用Lab Image Version 2.7.1對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 由于麻醉感染OVX組共5只大鼠死亡，去卵巢術(shù)后Sham組及OVX各亞組均隨機(jī)選取5只大鼠。腰椎(L2～L4)的骨密度(bone mineral density，BMD)通過雙能X射線吸收法(Lunar Prodigy Advance，GE Lunar，Madison,WI,USA)在麻醉下進(jìn)行檢測。Sham和OVX組的BMD分別為(225.54±28.35)mg/cm2和(162.45±25.33)mg/cm2。在定量分析中，Sham組的骨密度比OVX組高27.97%(t=3.711，P=0.006)；這些結(jié)果證實(shí)了去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥模型建立成功。

2.2 Micro-CT分析 缺損區(qū)域骨小梁的三維重建結(jié)果見圖1，骨微觀參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp如表1所示。治療8周后，CPC組、BCPC組和BSCPC組微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N高于Con組，而Tb.Sp低于Con組(P<0.05)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CPC、BCPC和BSCPC組之間的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且BSCPC組缺損區(qū)域具有最佳的微觀參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。

A：Con組；B：CPC組；C：BCPC組；D：BSCPC組。

表1 Micro-CT分析檢測BV/TV、Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th指標(biāo)比較

2.3 組織學(xué)分析 術(shù)后8周，Con組缺損被薄而疏松的結(jié)締組織填充，CPC、BCPC和BSCPC組新生骨量多于Con組。與Con組相比，BSCPC組和BCPC組缺損部位被較多的新形成骨組織充填，缺損區(qū)被修復(fù)較多，但是可見較多的生物材料殘留。與CPC或BCPC組相比，BSCPC組缺損部位從缺損邊緣到中心均可見大量的骨組織形成，可見較多成熟骨組織，只有較少的生物材料殘留(圖2)。

2.4 蛋白印跡分析 結(jié)果顯示，與Con組比較，CPC組、BCPC組和BSCPC組Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CPC、BCPC和BSCPC組之間的Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且BSCPC組缺損區(qū)域Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2表達(dá)上調(diào)最為明顯。見圖3和表2。

A：Con組；B：CPC組；C：BCPC組；D：BSCPC組。紅色箭頭：新生骨組織；黃色箭頭:未吸收材料。

圖3 Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

表2 檢測Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表達(dá)比較

3 討論

CPC因其抗壓強(qiáng)度，出色的生物相容性和骨傳導(dǎo)性及可吸收性而在支架材料中脫穎而出。盡管具有上述優(yōu)點(diǎn)，但缺乏骨誘導(dǎo)性是CPC的關(guān)鍵缺陷之一，這可能導(dǎo)致骨不連，特別是在修復(fù)骨質(zhì)疏松骨缺損方面。作為最具代表性的骨生長因子，BMP-2已獲得美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMEA)的批準(zhǔn)，用于治療骨不連或者促進(jìn)脊柱融合[10]。Sr在元素周期表中與鈣元素屬于同族元素，Sr能有效抑制破骨細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性。因此，Sr元素一直作為骨質(zhì)疏松研究領(lǐng)域中的“明星”元素；一方面，在成骨細(xì)胞富集的細(xì)胞中，能增大膠原蛋白與非膠原蛋白的合成，通過增強(qiáng)前成骨細(xì)胞的增殖而促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。另一方面，能劑量依賴地抑制前破骨細(xì)胞的分化，從而抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收[11]。

在目前的工作中，我們通過將Sr2+和BMP-2引入CPC來增強(qiáng)骨骼組織生長，從而開發(fā)出完善的CPC骨骼替代材料。為了開發(fā)一系列SCPC，將碳酸鍶(SrCO3)顆粒與不同含量(0和5 wt.%)的CPC粉末均勻混合[12]。雖然更高劑量的BMP-2可以取得更好的結(jié)果，但是顯著增加不良反應(yīng)的發(fā)生率，如逆行射精，抗體形成，神經(jīng)根炎，術(shù)后神經(jīng)根損傷，異位骨化，血腫形成，傷口愈合并發(fā)癥和新發(fā)腫瘤等風(fēng)險(xiǎn)[13]。在本研究中，我們觀察到較低劑量BMP-2復(fù)合Sr修飾CPCP可以改善BMP-2復(fù)合CPCP修復(fù)骨缺損效果。與CPC和BCPC組相比，BSCPC治療骨缺損時(shí)，骨組織形成迅速，Mciro-CT檢測結(jié)果顯示具有較高BV/TV、Tb.N和Tb.Th及較低Tb.Sp，這表明BSCPC修復(fù)骨缺損效果更佳。

研究表明Notch 信號(hào)通路不僅影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管形成[14]，而且在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及成骨過程中作用巨大[15]。因此Notch信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞影響和血管的生成、以及對(duì)成骨細(xì)胞功能和在骨修復(fù)過程中都有重要的作用。RUNX-2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及成骨過程中也起到重要作用。本研究使用蛋白印跡觀察Notch信號(hào)通路Notch 1、CBF 1和Jagged 1和RUNX-2表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSCPC組的RUNX-2、Notch 1、CBF 1和Jagged 1蛋白表達(dá)水平高于CPC和BCPC組，表明BMP-2復(fù)合Sr修飾CPC材料修復(fù)骨質(zhì)疏松骨缺損可能和Notch信號(hào)通路激活和RUNX-2表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

這項(xiàng)關(guān)于臨界骨缺損修復(fù)的研究結(jié)果表明，將BMP-2修飾摻鍶CPC將有望快速實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨缺損修復(fù)。但具體機(jī)制和最佳組合劑量還需要進(jìn)一步研究。