葛根對(duì)細(xì)菌性腹瀉模型小鼠淋巴細(xì)胞水平和胃腸傳輸功能的影響研究*

董 娟，徐 杰，王新國(guó)，郭紅梅

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科(烏魯木齊 830000)

胃腸道感染是兒童高發(fā)疾病，其中細(xì)菌性腹瀉因占據(jù)重要位置。有研究顯示[1]，Th1、Th2、Th17 淋巴細(xì)胞為主要代表的是 CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群在感染性疾病和免疫相關(guān)等疾病中發(fā)揮著重要作用，故假設(shè)某種干預(yù)措施如果可以調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 淋巴細(xì)胞的表達(dá)，應(yīng)該可以實(shí)現(xiàn)治療細(xì)菌性腹瀉的目標(biāo)。中藥復(fù)方因服用不便影響了患者的治療依從性，因此單味中藥以其簡(jiǎn)效便廉的優(yōu)勢(shì)逐漸成為研究重點(diǎn)。葛根具有升陽(yáng)止瀉的功效，可有效治療細(xì)菌性腹瀉[2]，但其作用機(jī)制目前尚不明了，基于此我們以細(xì)菌性模型鼠為觀察對(duì)象，利用葛根干預(yù)，以期探討其可能作用機(jī)制，具體如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 動(dòng)物：30只健康雄性昆明小鼠(購(gòu)自廣州市賽柏諾生物科技有限公司，編號(hào)：2612015007771)，均飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重20～25 g，平均(22±1.5)g，周齡6～7周，平均(6±0.5)周。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(24±1.5)℃，濕度(50±2)%。本研究方案經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)審批(審批號(hào)283921)。

1.2 藥物：葛根粉(購(gòu)自安徽四全藥業(yè)，批號(hào)2322)。提取過(guò)程如下：葛根經(jīng)水提→70%醇沉→氨水溶解→氯仿萃取→沉淀→丙酮溶解、回收→濃縮液。將濃縮液溶解成30 mg/(kg·d)水溶性葛根備用。

1.3 試劑與儀器：致病性大腸桿菌(EPEC-E2348/69，購(gòu)自國(guó)家普通微生物菌種保藏管理中心)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Attune NxT)，血細(xì)胞分析儀(武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：URIT-2981)、胃動(dòng)素試劑盒(研域上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)：3423)、血管活性腸肽(研域上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào)：4233)。

2 研究方法

2.1 分組及造模方法：30只健康雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為模型組、干預(yù)組及空白組，各10只。各組小鼠體重、周齡等一般情況方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可進(jìn)行組間比較。依據(jù)參考文獻(xiàn)[3]對(duì)模型組及干預(yù)組小鼠進(jìn)行細(xì)菌性腹瀉模型制備，具體如下：對(duì)模型組、干預(yù)組小鼠灌胃0.3 ml的3% 碳酸氫鈉溶液30 min后再灌入0.5 ml的濃度5 × 108cfu/ml致病性 EPEC 混懸液，隨后將小鼠回籠飼養(yǎng)，隨后觀察各組小鼠的排便情況。空白組小鼠接受等劑量0.9%Nacl灌胃后回籠飼養(yǎng)。小鼠出現(xiàn)黏液便、稀便視為造模成功。

2.2 干預(yù)方法：成模后對(duì)干預(yù)組小鼠進(jìn)行30 mg/(kg·d)葛根水溶性生物堿藥液灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；模型組和空白組小鼠接受等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。

3 觀察指標(biāo)

3.1 腹瀉次數(shù)：記錄小鼠7 d腹瀉的總次數(shù)、腹瀉平均次數(shù)。

3.2 血數(shù)量變化：干預(yù)7 d后各組隨機(jī)取3只小鼠，取尾靜脈血，置于血球血細(xì)胞分析儀中進(jìn)行測(cè)定，記錄其中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比的數(shù)值。

3.3 外周血中Th1、Th2、Th17表達(dá)水平檢測(cè)：取尾靜脈血，加入小鼠淋巴細(xì)胞分離液后充分分離出淋巴細(xì)胞，收集于流式管內(nèi)，隨后加入10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，孵育5 h后加入1 ml的固定/破膜工作液(1 ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3 ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋)，旋渦混勻；再避光孵育30 min，充分離心后摒棄上清液加入1 ml 10X Permeabilization Buffer，離心洗滌細(xì)胞，破膜15 min(室溫避光)，充分離心后摒棄上清液；加入100 μl 1X Permeabilization Buffer，再分別加入熒光素標(biāo)記的CD4(CD4-FITC)、5 μl藻紅蛋白標(biāo)記的(IFN-γ-PE、IL-4-APC、IL-17A-APC)，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2、Th17細(xì)胞。

3.4 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A、胃動(dòng)素、血管活性腸肽的表達(dá)水平檢測(cè)：取尾靜脈血，離心取上清液，用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將0.1 ml緩沖液加至反應(yīng)孔內(nèi)，4 ℃下孵育過(guò)夜后摒棄反應(yīng)液，再加入0.1 ml樣本，37 ℃下孵育60 min，后加入0.1 ml酶標(biāo)抗體，37 ℃下孵育60 min，隨后再加入TMB、硫酸，充分反應(yīng)后將反應(yīng)孔板置于酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定IL-4、IFN-γ、IL-17、胃動(dòng)素、血管活性腸肽的表達(dá)水平。

3.5 結(jié)腸傳輸時(shí)間：將直徑1 mm的玻璃球經(jīng)小鼠肛門(mén)逆插入2 cm處，然后記錄玻璃球從肛門(mén)排出的時(shí)間作為結(jié)腸傳輸時(shí)間。

3.6 各組胃平滑肌層Obestatin及其受體GPR39 表達(dá)：干預(yù)7 d結(jié)束后每組隨機(jī)取3只小鼠，麻醉處死后冰上進(jìn)行開(kāi)腹，游離大小網(wǎng)膜，取約4 cm×3 cm胃體，充分清洗后將胃平滑肌層充分剝離，冰浴中剪碎組織后加入蛋白裂解液，充分反應(yīng)后4 ℃ 10000 r/min，離心30 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度后制定標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，隨后將樣本置于SDS-PAGE 凝膠電泳分離出靶蛋白，隨后將靶蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉后加入一抗抗體(1∶1000稀釋)，4 ℃下孵育24 h后用PBS洗滌條帶，加入AP 標(biāo)記的二抗(鼠抗兔 1∶1000)，室溫下孵育1 h后再用PBST 洗脫3次，5 min/次，滴加ECL顯影液顯影攝片。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。組間比較采用方差分析;組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠腹瀉次數(shù)比較 見(jiàn)表1?？瞻捉M小鼠未出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，模型組及干預(yù)組小鼠在造模6 h內(nèi)均出現(xiàn)黏液便/稀便。經(jīng)過(guò)葛根干預(yù)后小鼠腹瀉次數(shù)明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠腹瀉情況比較(次)

2 各組小鼠血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)比較 見(jiàn)表2。造模后小鼠Th1、Th2細(xì)胞百分比、白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比明顯下降，Th17細(xì)胞百分比升高，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)過(guò)干預(yù)后上述指標(biāo)較前改善，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠血細(xì)胞水平變化比較(%)

3 各組小鼠胃動(dòng)素、血管活性腸肽、結(jié)腸傳輸時(shí)間表達(dá)比較 見(jiàn)表3、4。造模后IL-17A、胃動(dòng)素、血管活性腸肽表達(dá)明顯升高，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平降低，結(jié)腸傳輸時(shí)間明顯縮短，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)過(guò)葛根干預(yù)后上述指標(biāo)明顯改善，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A水平變化比較(pg/ml)

表4 各組小鼠胃動(dòng)素、血管活性腸肽水平變化比較

4 各組胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達(dá) 造模后小鼠胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達(dá)明顯下降，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)過(guò)葛根干預(yù)后Obestatin、GPR39表達(dá)明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 各組胃平滑肌層Obestatin及GPR39變化

討 論

本研究小鼠在經(jīng)過(guò)致病性大腸桿菌感染后均出現(xiàn)了黏液便、稀便的癥狀，這是由于細(xì)菌導(dǎo)致模型鼠腸道黏膜完整性及上皮細(xì)胞受破壞，細(xì)菌毒素侵入導(dǎo)致腸道局部體液分泌增多而導(dǎo)致，由此我們發(fā)現(xiàn)小鼠外周血細(xì)胞成分也出現(xiàn)了變化，炎癥細(xì)胞百分比明顯升高，由此揭示本研究小鼠成功模擬腸道細(xì)菌感染，模型制備成功。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Th1、Th2、Th17以及代表性因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A表達(dá)已出現(xiàn)了變化，且胃平滑肌層的Obestatin 及其受體GPR39，這意味著腸道黏膜免疫系統(tǒng)和全身的免疫系統(tǒng)均產(chǎn)生了應(yīng)答。

有研究[4-6]指出細(xì)菌性腹瀉等變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)生時(shí)體內(nèi)的IL-2可發(fā)揮促進(jìn)、維持淋巴T細(xì)胞活化增殖的作用，IL-4是活化B淋巴細(xì)胞的重要因子，促其分泌IgE和 IgG1，并誘導(dǎo) IgG 加速轉(zhuǎn)型成IgE，以自分泌的方式誘導(dǎo)Th2的同時(shí)抑制Th1增殖及其應(yīng)答。IL-10是抑制性細(xì)胞因子，它的濃度高低直接關(guān)系IL-2、IFN-γ等促炎因子的表達(dá)水平，并對(duì)Th1的免疫應(yīng)答亦產(chǎn)生抑制作用。此外，IL-10作為一類(lèi)抗炎介質(zhì)對(duì)腸道毒素引發(fā)的炎癥有一定的滅活效應(yīng)，有研究人員[7]指出模型鼠在接受葡萄球菌腸毒素注射4 h內(nèi)其外周血IL-10濃度明顯提高，認(rèn)為機(jī)體在接受葡萄球菌腸毒素時(shí)應(yīng)激性地誘發(fā)IL-10分泌，以保護(hù)腸道黏膜，且在抑制IL-10表達(dá)后模型鼠死亡率明顯上升，在使用IFN-γ 抗體后模型鼠的腸道感染癥狀明顯好轉(zhuǎn)，這進(jìn)一步說(shuō)明了IL-10確有明顯的抑制炎癥效應(yīng)，其作為T(mén)h2代表性因子確實(shí)參與細(xì)菌性腹瀉的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)研究數(shù)據(jù)一致[8-10]，IL-2/IL-4/IFN-γ/IL-10水平的上調(diào)可發(fā)揮抑制炎癥擴(kuò)散的作用，避免了炎性連鎖反應(yīng)。IL-17A是Th17淋巴細(xì)胞的代表性印制，其作用中藥的促炎因子介導(dǎo)IL-6、IL-8 等炎癥因子的募集及趨化，同時(shí)還可活化中性粒細(xì)胞以加劇炎癥效應(yīng)。IL-17A在感染急性期處于高水平可促使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，有研究[11]顯示在感染急性期中和IL-17A的表達(dá)可減輕模型鼠的炎癥反應(yīng)。因此我們有理由相信上調(diào)Th1、Th2以及其代表因子IL-2/IL-4/IFN-γ/IL-10水平，抑制Th17淋巴百分比及其代表因子IL-17A的表達(dá)是有效治療細(xì)菌性腹瀉的關(guān)鍵。

Obestatin是機(jī)體重要的酰胺化腦腸肽物質(zhì)，是 G 蛋白偶聯(lián)受體GPR39 的內(nèi)源性配體，在腸道有大量表達(dá)[12-13]。Obestatin/GPR39 系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道血流而發(fā)揮抑制腸道收縮的效應(yīng)，與此同時(shí)，Obestatin/GPR39 系統(tǒng)還可抑制巨噬細(xì)胞的抗原體成活性，減少炎癥反應(yīng)引發(fā)的免疫應(yīng)答過(guò)程發(fā)動(dòng)機(jī)率。研究中我們還檢測(cè)了胃動(dòng)素、血管活性腸肽的表達(dá)，其中胃動(dòng)素屬于興奮性腸道激素，其濃度上調(diào)可明顯促進(jìn)胃運(yùn)動(dòng)和胃電活動(dòng)；血管活性腸肽可促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，還可誘導(dǎo)IL-10的分泌。本研究結(jié)果顯示造模后小鼠胃動(dòng)素、血管活性腸肽表達(dá)明顯升高，胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達(dá)明顯下降，這說(shuō)明細(xì)菌性腹瀉小鼠腸道蠕動(dòng)增強(qiáng)[14-16]，抑制胃動(dòng)素、血管活性腸肽表達(dá)，上調(diào)Obestatin/GPR39表達(dá)可實(shí)現(xiàn)治療細(xì)菌性腹瀉的目的。

細(xì)菌性腹瀉屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，多與外邪侵入、飲食不節(jié)等導(dǎo)致脾失健運(yùn)、腸道失司等有關(guān)，脾胃及腸道是主要病位，脾虛濕盛是該病發(fā)生發(fā)展的主要病機(jī)。葛根在《神農(nóng)本草經(jīng)》是被列為主藥，有解肌退熱、生津透疹、升陽(yáng)止瀉的作用，葛根素、大豆苷等異黃酮類(lèi)化合物是葛根的主要成分，臨床不乏其可有效改善腹瀉癥狀的報(bào)道。在本研究中我們利用單味中藥干預(yù)細(xì)菌性腹瀉模型鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型鼠的腹瀉次數(shù)明顯減少，縮短了結(jié)腸傳輸時(shí)間，并上調(diào)了Th1、Th2細(xì)胞百分比、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39水平，抑制白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、Th17細(xì)胞百分比、IL-17A的濃度，這說(shuō)明葛根可明顯改善胃腸感染，其作用機(jī)制與介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)。