電針對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦組織細胞凋亡及p-GSK-3β、GLUT1蛋白表達的影響*

孟曉鵬,楊 歡,王瑞輝

陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712046)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)為神經(jīng)外科最常見的腦部創(chuàng)傷性疾病[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學根據(jù)本病發(fā)作時間將其分為原發(fā)性顱腦損傷和繼發(fā)性顱腦損傷兩大類[3]，前者是由機械力引起腦組織的直接破壞；后者是原發(fā)性損傷后在損傷局部和周圍出現(xiàn)的組織和細胞的病理生理變化，包括神經(jīng)細胞的缺血缺氧、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、炎癥反應(yīng)、繼發(fā)感染及細胞凋亡等一系列變化[4-5]。在上述病理生理變化過程中，均可以導致細胞凋亡的發(fā)生。細胞凋亡是神經(jīng)細胞死亡的一種形式，TBI后細胞凋亡的發(fā)生是由于繼發(fā)性病理生理改變激活神經(jīng)細胞的膜信號系統(tǒng),使調(diào)控細胞凋亡的程序基因被啟動，從而導致神經(jīng)細胞程序性的自我破壞或死亡[6-7]，引起一系列神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。現(xiàn)代研究表明針灸療法對TBI的治療具有確切的療效，臨床研究顯示，電針療法對重型TBI患者促醒作用及改善患者后遺癥期肢體運動功能等都具有顯著的效果[8-10]。實驗研究證實針刺可以使TBI后腦組織損傷區(qū)域細胞膜的穩(wěn)定性得到改善，減輕腦水腫的發(fā)生，提高腦細胞對氧的攝取能力，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11-14]。本實驗從電針對TBI大鼠腦組織細胞凋亡以及p-GSK-3β及GLUT1表達的影響，探索電針治療本病的部分效應(yīng)機制，為針灸治療本病的臨床推廣提供科學依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物及分組 從成都達碩動物實驗中心購進76只SPF級6周齡SD雄性大鼠，體重200±20 g，許可證編號：SCXK(川)2015-30，本次實驗嚴格遵守《國家醫(yī)學實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定進行飼養(yǎng)及處理。于陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學科研中心動物房進行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機選取60只大鼠進行TBI造模，預(yù)留空白組和假手術(shù)組各8只，造模過程中死亡6只，將造模成功的大鼠隨機分為模型組和針刺組各27只，在造模后3、7、14 d每個時間點取9只進行取材檢測。

2 主要試劑及儀器 免疫組化試劑盒：邁新生物公司(福州)，批號：Kit-9902；一步法TUNEL試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司(上海)，批號：C1086；蘇木-伊紅染色試劑盒：北京索萊寶科技公司，批號：G1120；DAB顯色試劑盒：邁新生物公司(福州)，批號：DAB-0031；p-GSK-3β(Ser9)抗體：Cell Signaling Technology，批號：#9323；GLUT1抗體：美國Novus公司，批號：NB110-39113。腦立體定位儀：金洋萬達科技公司(北京)，型號：ST-3ND；微型磨鉆：浩峰儀器設(shè)備有限公司，型號：P16011A。

3 動物模型制備 實驗動物于造模前8 h禁水禁食，采用改良Feeney’s自由落體打擊法制備TBI模型[15]。用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉(0.2 ml/100 g)，待麻醉生效后在大鼠頭正中線中點左側(cè)0.5 cm處切開1.5 cm切口，用微型磨鉆在冠狀縫后6 mm，矢狀縫左側(cè)旁開4 mm處開一直徑為5 mm的骨窗，將打擊頭放在骨窗上，選用20 g砝碼從高為35 cm的透明玻璃管中垂直下落撞擊打擊頭的尾部，造成左腦頂葉損傷，常規(guī)消毒后進行外科縫合，單籠常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后每天腹腔注射硫酸慶大霉素0.5 mg/100 g，連續(xù)治療7 d，預(yù)防術(shù)后感染的發(fā)生；假手術(shù)組SD大鼠只進行開顱，不打擊，具體手術(shù)方法同模型組及針刺組，術(shù)后常規(guī)給予抗感染治療；空白組不做任何處理。

4 電針干預(yù)方案 造模后1 d開始對針刺組大鼠電針治療，穴位選“百會、水溝”及患側(cè)“內(nèi)關(guān)及足三里”，針具選取華佗牌一次性針灸針(0.25×25 mm)，穴位定位及操作[16]：水溝直刺2 mm，行提插捻轉(zhuǎn)20 s后不留針；百會向前平刺5 mm；內(nèi)關(guān)斜刺5 mm，足三里斜刺10 mm。在內(nèi)關(guān)和足三里進行電針治療，采用2 Hz斷續(xù)波，15 min/次，1次/d，連續(xù)治療14 d，其余各組不予干預(yù)。

5 實驗取材及檢測方法 模型組和針刺組于造模后3、7、14 d分批進行取材，每次取9只；空白組和假手術(shù)組于造模后14 d統(tǒng)一取材，每組8只。用2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉后開胸，暴露心臟，用輸液器于心尖部穿刺后進行冰生理鹽水灌注，待全身血液被沖出體外后，快速斷頭取腦，將取出的腦組織放入冰4%多聚甲醛中固定，不超過24 h，固定結(jié)束后進行組織脫水及包埋，后期進行石蠟包埋切片。

5.1 HE染色：染色前將石蠟切片常規(guī)脫蠟；脫蠟完成后依次按照以下順序進行染色：蘇木素染色5 min，純水洗3 min，伊紅染色1 min，純水洗1 min，分化液分化10 s；染色完成后對組織進行梯度乙醇脫水及二甲苯透明；再用中性樹膠封片。

5.2 細胞凋亡:石蠟切片常規(guī)脫蠟；脫蠟完成后在每個組織上滴加20 μg/ml的不含DNase的蛋白酶K，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min，PBS洗滌5 min×3次；然后在每個樣品上滴加配置好的tunel檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌5 min×3次；用抗熒光淬滅液進行封片后顯微鏡下觀察并拍照。

5.3 免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟后進行抗原修復；完成后加3%過氧化物酶阻斷劑反應(yīng)，PBS清洗后用再進行封閉，加一抗溶液4 ℃過夜；次日復溫后依次加反應(yīng)增強液及聚合物；最后進行DAB顯色；最后進行蘇木素染核，染色完成后對組織進行梯度乙醇脫水及二甲苯透明，結(jié)束后用中性樹膠封片。

結(jié) 果

1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果 空白組和假手術(shù)組大鼠腦組織HE染色可見組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，輪廓清楚，染色均勻，無組織細胞水腫及壞死；針刺組及模型組大鼠腦組織在術(shù)后3 d出現(xiàn)不同程度的壞死空洞區(qū)、腦組織結(jié)構(gòu)疏松、細胞排列紊亂，形態(tài)異常，細胞水腫及細胞碎裂等表現(xiàn)；但隨著時間的推移，在術(shù)后7、14 d針刺組大鼠腦組織的病灶范圍逐漸縮小，腦組織水腫及組織疏松逐漸減輕，損傷部位逐漸得到修復，而同時間點模型組大鼠腦組織整體修復情況較針刺組差(圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織情況(HE染色，×200)

2 各組大鼠腦組織細胞凋亡結(jié)果 見表1(圖2)。采用TUNEL法檢測各組腦組織中細胞凋亡的情況，凋亡細胞可被染成黃綠色類圓形狀，空白組和假手術(shù)組可見少量正常的神經(jīng)細胞凋亡，造模后3 d模型和針刺組造模后可見大量的凋亡細胞，但隨著觀察時間的變化，7、14 d時模型組和針刺組細胞凋亡的數(shù)量逐漸減少，同時間點針刺組減少較模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，至造模后14 d，模型組和針刺組的凋亡數(shù)量仍較空白組和假手術(shù)組多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腦組織中細胞凋亡(TUNEL法，×100)

表1 各組大鼠腦組織細胞凋亡數(shù)(個)

3 各組大鼠腦組織中p-GSK-3β蛋白免疫組化表達結(jié)果 見表2(圖3)。通過免疫組化染色，可見p-GSK-3β蛋白的陽性表現(xiàn)為類圓形棕褐色斑片狀，空白組和假手術(shù)組有少量p-GSK-3β蛋白陽性表達，模型組和針刺組均存在不同程度增多的陽性表達；與同時期模型組相比，針刺組的p-GSK-3β表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；至造模后14 d，針刺組p-GSK-3β蛋白表達量與空白組、假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組p-GSK-3β蛋白的表達量與空白組、假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。

圖3 各組大鼠腦組織中p-GSK-3β的表達(免疫組化染色，×200)

表2 各組大鼠中p-GSK-3β表達平均光密度比較

4 各組大鼠腦組織中GLUT1蛋白免疫組化表達的結(jié)果 見表3(圖4)?？瞻捉M和假手術(shù)組腦組織中存在一定量的GLUT1蛋白的表達，且表達量相當，調(diào)控著正常的組織代謝及細胞活動；造模后模型組和針刺組GLUT1陽性表達均增高，與同時間點模型組相比，針刺組的GLUT1陽性表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在造模后14 d，模型組和針刺組的GLUT1蛋白的表達仍高于空白組和假手術(shù)組(P<0.01)。

表3 各組大鼠腦組織中GLUT1表達平均光密度比較

圖4 各組大鼠腦組織中GLUT1蛋白的表達(免疫組化染色，×200)

討 論

創(chuàng)傷性顱腦損傷屬于中醫(yī)學中“頭部內(nèi)傷病”的范疇[17]，祖國醫(yī)學認為腦為“奇恒之腑”，稱為“元神之府”“髓?！?，陳無擇在《三因極-病證方論》中記載：“頭者，諸陽之會……百神所聚”，可見頭部在全身有著重要的作用。顱腦損傷在古代屬于危急重癥，《仙授理傷續(xù)斷秘方》記載：“凡腦骨傷碎……斷然不可治矣”；清代錢文彥在《外科補要》中記載了“高墜下傷”“巔頂骨折”等病因病機，并指出其機理關(guān)鍵在于“血癖”[18]。所以本病的發(fā)生多為外傷導致腦部受損，瘀血停留，經(jīng)絡(luò)受阻。本實驗選取百會、人中、內(nèi)關(guān)和足三里四個常用腧穴，配合電針對TBI大鼠進行干預(yù)治療，探討電針干預(yù)對減輕TBI后的神經(jīng)功能損傷的作用機理?！鞍贂⑺疁稀笨梢哉{(diào)和陰陽，醒腦開竅；“足三里、內(nèi)關(guān)”可以通經(jīng)活絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)針刺百會可以明顯降低腦缺血組織缺血區(qū)NF-κB p65和Caspase-3的表達，減輕細胞凋亡的發(fā)生[19]；針刺水溝，內(nèi)關(guān)可以使缺血腦組織中PARP-1 及Caspase-3的mRNA和蛋白表達下降，改善神經(jīng)功能癥狀，從而保護神經(jīng)元[20]；針刺水溝穴也可明顯抑制細胞凋亡的發(fā)生，使神經(jīng)功能得到重建[21]。

TBI發(fā)生后其原發(fā)性損傷是無法治療的，重在預(yù)防，所以現(xiàn)代醫(yī)學針對本病的治療方案主要是抑制創(chuàng)傷后的繼發(fā)性損傷[22]。研究證實，在TBI發(fā)生后，損傷局部會出現(xiàn)缺血缺氧的“半暗帶區(qū)”，神經(jīng)細胞的缺血缺氧會啟動凋亡程序，引起神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生[23-24]，所以從針灸干預(yù)挽救半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞，減輕細胞凋亡是一個新的研究方向。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種存在于細胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[25]，可通過激活線粒體內(nèi)源性凋亡信號通路中的Bcl-2家族中的凋亡前蛋白，啟動凋亡程序，因此GSK-3β也被認為是細胞程序性死亡的上游調(diào)節(jié)因子[26-27]。當GSK-3β氨基端的Ser9磷酸化后可形成p-GSK-3β(磷酸化的糖原合成酶激酶-3β)，p-GSK-3β的含量增高可抑制GSK-3β的活性，從而起到抑制凋亡的作用[28]。p-GSK-3β也可以通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)的開放來避免細胞凋亡的發(fā)生[29]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(GLUTs)是負責葡萄糖等物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運的一類轉(zhuǎn)運蛋白,其中GLUT1(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1)主要分布在大腦的血腦屏障上，是負責將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運到神經(jīng)細胞外液中，為大腦神經(jīng)細胞進行供能[30-31]。足夠的能量供應(yīng)對提高腦缺血組織的腦細胞活力，穩(wěn)定膜電位，減輕細胞代謝紊亂，延遲能量衰竭引起的級聯(lián)反應(yīng)，抑制神經(jīng)細胞凋亡起到重要的作用[32-33]。p-GSK-3β還可通過TSC/mTOR(結(jié)節(jié)性硬化癥復合體/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路促進誘導GLUT1的轉(zhuǎn)錄，增加細胞的存活[34]。

本實驗結(jié)果表明，電針干預(yù)可以明顯提高針刺組大鼠腦組織中p-GSK-3β及GLUT1蛋白的表達，與模型組相比具有顯著差異；TUNEL染色可見造模后3 d大鼠腦組織細胞凋亡達到高峰，但隨著時間的改變，在造模后7、14 d時大鼠腦組織的細胞凋亡數(shù)也逐漸減少，同時間點針刺組較模型組減少更顯著；且隨著觀察時間的改變，針刺組大鼠腦組織HE染色可見損傷病灶范圍逐漸縮小，腦組織水腫及組織疏松逐漸減輕，損傷部位逐漸得到修復，而模型組大鼠腦組織整體修復情況較差?；谏鲜鼋Y(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)可能通過提高腦組織中p-GSK-3β及GLUT1蛋白的表達，從而減少神經(jīng)細胞凋亡，改善大鼠腦組織損傷區(qū)域及周圍組織的病理損傷狀況，對TBI后的神經(jīng)細胞具有一定的保護作用，減輕TBI后的神經(jīng)繼發(fā)性損害。