尿激酶、低分子肝素對(duì)膿毒癥彌散性血管內(nèi)凝血大鼠模型的影響研究*

尤金枝，王捷虹，高麥倉(cāng)，王瑞哲，任耀龍，王晨曦，王 博，梁嘉斌，劉 旺，于 勇

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽(yáng)712000)

膿毒癥是由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，可導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1-3]。每年約有1800萬(wàn)人罹患膿毒癥[4]，而膿毒癥休克是急危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的棘手問(wèn)題[5]，是重癥醫(yī)學(xué)科危重病患者的首要死因[6]，臨床病死率高[7-8]。膿毒癥導(dǎo)致的彌散性血管內(nèi)凝血(Diffuse intravascular coagulation，DIC)占發(fā)病總數(shù)的25%～50%，如何有效防治膿毒癥所致DIC很有研究?jī)r(jià)值?；诖耍覀冞M(jìn)行尿激酶(Urokinase，UK)及低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWH)對(duì)膿毒癥DIC大鼠模型的干預(yù)效應(yīng)研究，為臨床規(guī)范應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐和理論依據(jù)。

材料與方法

1 研究材料

1.1 動(dòng)物及分組：健康SD大鼠100只，雌雄各半(排除孕鼠)，體質(zhì)量180～200 g，周齡7～8周。將動(dòng)物隨機(jī)分為六組：生理鹽水(Normal saline，NS)對(duì)照組30只，分為NS(1 h)、NS(2 h)、NS(4 h)三個(gè)亞組，各10只；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)造模組30只，分為L(zhǎng)PS(1 h)、LPS(2 h)、LPS(4 h)三個(gè)亞組，各10只；尿激酶組(UK)10只；脂多糖造模+尿激酶組(LPS+UK)10只；低分子肝素組(LMWH)10只；脂多糖造模+低分子肝素組(LPS+LMWH)10只。

1.2 藥物：低分子量肝素鈣注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20163060)，注射用尿激酶(國(guó)藥準(zhǔn)字H32021989)，戊巴比妥。

1.3 試劑和儀器：血漿凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶原時(shí)間(Activated partial prothrombin time，APTT)、纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)BG)、D-二聚體(D-dimer，DD)、血小板(Platelet，PLT)試劑，內(nèi)毒素；全自動(dòng)凝血分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司， RAC-1800)，電子分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司， FA2004B)，離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，75002440)，移液槍(德國(guó)艾本德股份公司，Eppendorf AG)，全自動(dòng)正置顯微鏡(日本Nikon eclipse，90i)。

2 研究方法 實(shí)驗(yàn)前空腹12 h，1%戊巴比妥(30 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉后按分組用微量泵經(jīng)尾靜脈輸入生理鹽水或藥物。與NS組比較，同時(shí)存在以下三項(xiàng)以上異常，即判斷造模成功： PT延長(zhǎng)3 s以上； APTT延長(zhǎng)5 s以上；FBG下降超過(guò)25%； PLT明顯降低； DD明顯升高；器官組織切片顯示微血管中出現(xiàn)纖維蛋白微血栓。輸注方法：①NS組：NS 2.5 ml/h×4 h；②UK組：NS 2.5 ml/h，在輸注1 h后，加入U(xiǎn)K 10 IU/(g·h)×3 h；③LPS組：LPS 30 mg/(kg·h)×4 h；④LPS+UK組：LPS 30 mg/(kg·h)，在輸注1 h后，加入U(xiǎn)K 10 IU/(g·h)×3 h；⑤LMWH組：NS 2.5 ml/h，輸注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h；⑥LPS+LMWH組：LPS 30 mg/(kg·h)，輸注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h。NS和LPS亞組分別于輸注后1 h、2 h、4 h，UK、LPS+UK、LMWH、LPS+LMWH各組分別于輸注后4 h，經(jīng)腹腔靜脈采集血樣，血液標(biāo)本一部分以3000 r/min離心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存、備測(cè)，另一部分以3.8%枸櫞酸鈉1∶5抗凝或EDTA抗凝待測(cè)。

3 觀察指標(biāo) 對(duì)比各組PT、APTT、PLT、DD、FBG、纖維蛋白原降解產(chǎn)物(Fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP)及出血率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 輸注LPS后凝血及纖溶指標(biāo)變化情況 見(jiàn)表1。隨著輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，與NS組比較，LPS組PT、APTT逐漸延長(zhǎng)，DD逐漸增加，F(xiàn)BG、PLT逐漸降低。這種變化在輸注1 h開(kāi)始出現(xiàn)，2 h達(dá)高峰，在2～4 h呈平臺(tái)趨勢(shì)，表明LPS持續(xù)泵入1 h后即可達(dá)到膿毒癥DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 LPS組與NS組凝血及纖溶指標(biāo)比較

2 UK、LMWH干預(yù)前后凝血及纖溶指標(biāo)變化 見(jiàn)表2。與NS(4 h)組比較，UK組和LMWH組PT、APTT延長(zhǎng)(均P<0.05)，而FBG、FDP、DD、PLT改變不明顯(P>0.05)，且UK組較LMWH組 PT、APTT延長(zhǎng)更明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；LPS(4 h)組PT、APTT延長(zhǎng)，F(xiàn)BG、PLT下降，DD升高。與LPS(4 h)組相比較，LPS+UK組和LPS+LMWH組PT、APTT縮短，F(xiàn)BG、FDP、PLT升高，DD下降(P<0.05)，但未恢復(fù)到NS組水平，提示UK、LMWH可改善DIC模型大鼠凝血及纖溶功能。

表2 各組給藥后凝血及纖溶指標(biāo)比較

3 出血率比較 見(jiàn)表3。在研究過(guò)程中，UK組和LPS+UK組7只大鼠出現(xiàn)了瞼結(jié)膜充血、腹部皮膚青紫及肺出血的情況，而LPS組和LPS+LMWH組大鼠未出現(xiàn)類(lèi)似情況，LMWH組和LPS+LMWH組與NK組和LPS+UK組出血率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明LMWH較UK更安全。

表3 UK組和LPS+UK組與LMWH組和LPS+LMWH組出血率比較[例(%)]

討 論

膿毒癥是ICU患者主要死因[9]。近年來(lái)，隨著對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，逐漸認(rèn)識(shí)到膿毒癥是感染病原體與宿主免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、凝血反應(yīng)之間相互作用，相繼啟動(dòng)炎性細(xì)胞，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)凝血，從而形成一整套造成機(jī)體器官功能損害的復(fù)雜臨床綜合征[10]，機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡和凝血系統(tǒng)功能紊亂都是膿毒癥發(fā)病的重要機(jī)制的中間環(huán)節(jié)，而兩者之間的相互作用關(guān)系更是臨床DIC以及進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能障礙綜合征的重要標(biāo)志之一[11]。DIC是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]，隨著病情進(jìn)展，合并DIC的膿毒癥，其病死率高[13]。因此，正確評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度，嚴(yán)密監(jiān)測(cè)凝血功能，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)干預(yù)DIC，對(duì)患者預(yù)后具有非常重要的意義。在膿毒癥中，凝血啟動(dòng)與炎癥反應(yīng)的交叉、微血栓的形成需要采用抗凝劑治療，以避免各種因子出現(xiàn)瀑布樣激發(fā)，從而減弱器官功能障礙及損傷。目前，部分國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于研究適于臨床廣泛應(yīng)用且安全有效的抗凝劑，以治療嚴(yán)重膿毒癥。重癥感染患者早期應(yīng)用抗凝劑治療可能會(huì)受益[14]。袁凱鋒等[15]研究表明，尿激酶對(duì)改善LPS誘導(dǎo)的Wistar大鼠DIC模型出現(xiàn)的凝血及纖溶異常、器官功能障礙具有積極作用。而對(duì)于高?；颊吆喜IC但無(wú)出血癥狀者，推薦使用預(yù)防劑量肝素或小劑量低分子肝素[16]。段圣潔等[17]研究表明，新生兒膿毒癥合并DIC采用低分子肝素治療，抗凝效果顯著，安全性高。

盡管對(duì)于凝血功能紊亂和炎癥反應(yīng)在膿毒癥并DIC中發(fā)病機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)于初期凝血功能紊亂的檢查手段非常有限，無(wú)法尋得真正有效的解決途徑。在之前的臨床研究中，我們?cè)谂懦勺C的情況下，對(duì)于膿毒癥患者及時(shí)予以UK或LMWH治療[18]，療效確切，但其作用機(jī)制有待在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上進(jìn)行更深入的研究?；诖?，我們進(jìn)行UK及LMWH對(duì)膿毒癥DIC大鼠模型的干預(yù)效應(yīng)研究，通過(guò)建立膿毒癥DIC大鼠模型，檢測(cè)凝血指標(biāo)、纖溶指標(biāo)等，分析其對(duì)微循環(huán)障礙及纖溶活性的作用，考察UK、LMWH對(duì)膿毒癥DIC大鼠模型的影響。在LPS持續(xù)泵入1 h后，即達(dá)到膿毒癥DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，表明造模成功；隨著輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，與NS組比較，LPS組PT、APTT逐漸延長(zhǎng)，DD逐漸增加，F(xiàn)BG、PLT逐漸降低；經(jīng)UK、LMWH干預(yù)后，PT、APTT縮短，F(xiàn)BG、PLT升高，DD下降，與LPS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LMWH組和LPS+LMWH組的出血率低于NK組和LPS+UK組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果表明，UK和LMWH均可防治膿毒癥DIC。然而，因?yàn)镈IC分為高凝期、消耗性低凝期、繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)期，因此對(duì)于無(wú)抗凝禁忌證的膿毒癥并發(fā)DIC高凝期患者，可早期應(yīng)用抗凝劑(尿激酶或低分子肝素)，對(duì)預(yù)防DIC形成有積極意義，其通過(guò)改善微循環(huán)并干預(yù)纖溶活性而發(fā)揮防治DIC的作用。另外，UK對(duì)于已形成的血栓有溶栓作用，但高劑量的UK可能增加出血風(fēng)險(xiǎn)[19]，對(duì)于防治DIC、改善微循環(huán)，LMWH可能是更安全的選擇。