NLRP3炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在高熱量飲食小鼠認(rèn)知功能障礙中的作用

董 雯，倫永志，劉 奔，孫 杰，潘凌鴻

（莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100）

近年來(lái)，人們的日常膳食結(jié)構(gòu)中，高糖高脂等高熱量食物所占比例越來(lái)越重。高熱量食物的攝入是一種不健康的飲食行為，被報(bào)道與輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）和阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-3］。大量研究結(jié)果表明，高熱量飲食可誘導(dǎo)腦組織炎癥相關(guān)因子表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥發(fā)生，但其具體機(jī)制尚未明確［1，4-5］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，在包括認(rèn)知功能障礙疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［6］。NLRP3炎性小體活化，可激活下游一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)一種特殊的細(xì)胞程序性死亡——細(xì)胞炎性壞死，即細(xì)胞焦亡。高熱量飲食是否通過(guò)腦內(nèi)NLRP3 炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡影響認(rèn)知功能目前尚不清楚。本研究擬探討腦組織NLRP3 炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在高熱量飲食小鼠認(rèn)知功能障礙中的作用及可能機(jī)制，以期為高熱量飲食所致認(rèn)知功能障礙尋求潛在病因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組6 周齡雄性C57BL/6 小鼠20 只，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度約40%～60%，晝夜比12 h∶12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，利用隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為正常飲食組（CON 組）和高熱量飲食組（HCD 組），每組10 只。喂養(yǎng)期6 個(gè)月，自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用的相關(guān)法律法規(guī)。

1.2 主要試劑與儀器吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）雙熒光染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrogen 公司，PCR 引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，Gemini EM 熒光讀板機(jī)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)裝置購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，Morris 水迷宮購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物認(rèn)知功能檢測(cè)喂養(yǎng)6個(gè)月后，各組小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，在上午9∶00-12∶00進(jìn)行。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：3 d 訓(xùn)練期和1 d 測(cè)試期。訓(xùn)練期，在實(shí)驗(yàn)裝置底板放入2 個(gè)大小形狀完全相同的物體（A 和B），然后將小鼠以背對(duì)物體的方向放入實(shí)驗(yàn)裝置中，自由探索5 min。測(cè)試期，將物體A更換為完全不同的新物體C，測(cè)試5 min，分別記錄小鼠對(duì)每個(gè)物體B 和C 的探索時(shí)間，并計(jì)算識(shí)別系數(shù)，即測(cè)試期小鼠對(duì)新奇物體的探索時(shí)間與測(cè)試時(shí)間的比值。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)：5 d 定位航行試驗(yàn)和1 d 空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)，將平臺(tái)固定于水下1.5～2 cm 處，小鼠面向池壁放入水中，時(shí)間限制為60 s，記錄其到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)，將水下平臺(tái)撤除，小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠首次到達(dá)原平臺(tái)所在位置所用時(shí)間（視為d6 的逃避潛伏期）及60 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)。

1.3.2 標(biāo)本收集各組小鼠認(rèn)知功能檢測(cè)完成后，水合氯醛腹腔注射（3 mL·kg-1）處死后立即置冰盤(pán)斷頭取腦，快速剝離海馬組織，于液氮速凍，－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 AO/EB 熒光比色法將海馬組織剪碎并用0.25% 胰酶消化，混勻，4℃1000 r·min-1離 心5 min，取沉淀，加入50 μL AO/EB 染液，混勻，反應(yīng)1 min 后，用人工腦積液稀釋至200 μL，應(yīng)用熒光讀板機(jī)進(jìn)行測(cè)定并記錄樣本管和空白對(duì)照管的OD值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次。

1.3.4 RT-PCR 法檢測(cè)將海馬組織勻漿后，用Trizol 試劑提取總RNA。按照cDNA 合成試劑盒說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1。以GAPDH 為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，得平均Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 ELISA 法檢測(cè)在海馬組織中，加入裂解液勻漿，4 ℃離心后取上清，使用ELISA 試劑盒測(cè)定IL-1β和IL-18蛋白含量。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-）表示。除了逃避潛伏期組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其余數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 高熱量飲食小鼠認(rèn)知功能新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A 所示，HCD 組較CON 組對(duì)新物體C 的識(shí)別系數(shù)顯著降低（t=1.43，P＜0.05）。

Morris 水迷宮逃避潛伏期變化如圖1B 所示，兩組小鼠逃避潛伏期時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=5.64，P組間＜0.05），且第3 天開(kāi)始，HCD 組逃避潛伏路程顯著長(zhǎng)于CON組（t3=－9.19，P＜0.05；t4=－12.40，P＜0.05；t5=－8.67，P＜0.05 和t6=－8.97，P＜0.05）；CON 組與HCD 組小鼠逃避潛伏期時(shí)間均有隨時(shí)間縮短的趨勢(shì)（F時(shí)間=4.24，P時(shí)間＜0.05）；組間與時(shí)間無(wú)交互作用（F交互=1.02，P交互＞0.05）。穿越原平臺(tái)位置次數(shù)結(jié)果如圖1C 所示，HCD組較CON組次數(shù)顯著減少（t=4.39，P＜0.05）。

上述行為學(xué)結(jié)果提示，長(zhǎng)期高熱量飲食導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能明顯下降，發(fā)生障礙。

圖1 兩組小鼠新物體識(shí)別系數(shù)（A）、水迷宮逃避潛伏期（B）和穿越原平臺(tái)位置次數(shù)（C）的比較

2.2 高熱量飲食小鼠海馬組織細(xì)胞焦亡水平AO/EB 熒光比色法結(jié)果如圖2 所示，HCD 組較CON組OD 值顯著升高（t=－85.30，P＜0.05）。結(jié)果提示，長(zhǎng)期高熱量飲食導(dǎo)致小鼠海馬組織細(xì)胞焦亡水平升高。

2.3 高熱量飲食小鼠海馬組織NLRP3和Caspase 1 mRNA 表達(dá)水平RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，HCD 組較CON 組海馬組織NLRP3 和Caspase 1 mRNA 表 達(dá) 均 顯 著 升 高（t=－4.82，P＜0.05 和t=－3.95，P＜0.05）。

圖2 兩組小鼠AO/EB染色OD 值的比較

圖3 兩組小鼠海馬組織NLRP3和Caspase 1 mRNA表達(dá)水平的比較

2.4 高熱量飲食小鼠海馬組織IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平ELISA 檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示，HCD 組較CON 組海馬組織IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)均顯著升高（t=－17.58，P＜0.05和t=－23.12，P＜0.05）。

圖4 兩組小鼠海馬組織IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平的比較

3 討 論

本研究采用高熱量飲食6個(gè)月誘發(fā)認(rèn)知功能障礙小鼠模型，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理的小鼠對(duì)新物體的識(shí)別記憶能力顯著降低，水迷宮逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)顯著減少，海馬依賴(lài)性學(xué)習(xí)記憶能力受損，提示模型構(gòu)建成功，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致［7-8］。長(zhǎng)期高能量飲食可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，如產(chǎn)生MCI 和AD 等神經(jīng)退行性疾病，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變常伴隨神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展［4-5，9］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥水平的升高致神經(jīng)細(xì)胞死亡增加，與認(rèn)知功能下降和癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加有密切相關(guān)性［10］。高能量飲食可誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而有關(guān)神經(jīng)炎癥如何通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞死亡參與高熱量飲食致認(rèn)知功能障礙疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程鮮見(jiàn)報(bào)道。

細(xì)胞焦亡，又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死，是一種伴隨著炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式，近年來(lái)，其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病及防治研究備受關(guān)注。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞焦亡在AD 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［11］。細(xì)胞焦亡，不同于凋亡和壞死引起的細(xì)胞死亡方式，是在內(nèi)源性或外源性刺激下，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族（NLRs）蛋白激活，并與Caspase 1結(jié)合，形成炎性小體，進(jìn)而促進(jìn)關(guān)鍵促炎因子IL-1β 和IL-18 產(chǎn)生和釋放，啟動(dòng)并擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡發(fā)生必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件，即炎癥小體形成和促炎因子IL-1β和IL-18釋放［12］。

NLRP3 是NLRs 家族的重要成員之一，是一種主要的模式識(shí)別受體，不僅能識(shí)別病原微生物，還能識(shí)別內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)和某些代謝產(chǎn)物。識(shí)別活化后的NLRP3 將與Caspase 1 組成炎性小體，即NLRP3 炎性小體，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的炎性小體之一，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理中起關(guān)鍵作用。適度的NLRP3 炎性小體激活有助于快速而有效地清除病原微生物及其他各種危險(xiǎn)信號(hào)；持續(xù)過(guò)度的激活將導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷并參與AD、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展［13］。研究表明［14］，抑制NLRP3炎癥小體的激活可以改善AD 模型動(dòng)物的行為學(xué)和病理?yè)p害。到目前為止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)NLRP3 炎性小體的激活機(jī)制尚不明確，可能與胞內(nèi)鉀離子外流、溶酶體破壞、線(xiàn)粒體功能障礙及活性氧過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)［15］，高糖高脂等高熱量飲食所引起的體內(nèi)代謝異常，導(dǎo)致高血糖、高血脂，使神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體功能障礙及大量活性氧累積。本研究應(yīng)用RT-PCR 法檢測(cè)HCD 組小鼠海馬組織NLRP3 和Caspase 1的mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)較CON 組顯著升高；AO/EB 雙熒光染色表明，HCD 組小鼠海馬組織細(xì)胞死亡數(shù)量較CON 組顯著升高，提示NLRP3炎性小體的形成與高熱量飲食小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡密切相關(guān)，是認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。

NLRP3 炎癥小體是介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)途徑之一。Caspase 1 又稱(chēng)為IL-1β 轉(zhuǎn)化酶，可對(duì)無(wú)生物活性的IL-1β 前體和IL-18 前體進(jìn)行剪切，形成有生物活性的IL-1β 和IL-18，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致組織損傷，引起致炎性細(xì)胞死亡—細(xì)胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)［16］，敲除Caspase 1，腦組織神經(jīng)炎癥減輕和神經(jīng)元死亡減少。本研究應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HCD 組小鼠海馬組織IL-1β 和IL-18 的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)較CON 組顯著升高，提示高熱量飲食引起NLRP3炎性小體形成后，促炎因子IL-1β和IL-18 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生發(fā)展，是認(rèn)知功能障礙形成的重要機(jī)制之一。

綜上所述，細(xì)胞焦亡與高熱量飲食小鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展有著密切相關(guān)性，高熱量飲食通過(guò)激活海馬組織NLRP3 炎性小體，促進(jìn)關(guān)鍵促炎因子IL-1β 和IL-18 生成，進(jìn)而引起細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷。細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中任何一種物質(zhì)的生成或激活均可影響神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。需進(jìn)一步深入對(duì)高熱量飲食所致細(xì)胞焦亡相關(guān)信號(hào)通路的研究，以期為飲食相關(guān)神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展及防治提供重要的生物學(xué)依據(jù)。