• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠模型中神經(jīng)酰胺對(duì)血小板介導(dǎo)的輸血相關(guān)急性肺損傷的作用

    2020-09-08 02:33:30李應(yīng)明陳華伍
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)酰胺儲(chǔ)存抑制劑

    李應(yīng)明陳 華伍 燕

    (海南省??谑腥嗣襻t(yī)院輸血科,???570208)

    輸血相關(guān)急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury, TRALI)定義為輸血后前6 h 內(nèi)發(fā)生的非心源性肺水腫,是嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng),也是輸血相關(guān)死亡的首要原因[1-2]。 根據(jù)2015 年美國(guó)美食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)道,輸血引起的病毒感染顯著下降,而輸血導(dǎo)致的致死性不良反應(yīng)中位居前三位的依次是輸血相關(guān)急性肺損傷、溶血性輸血反應(yīng)和輸血相關(guān)膿毒血癥。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血小板制品中含有的多種免疫調(diào)節(jié)因子,諸如如血小板衍生的生長(zhǎng)因子、可溶性CD40 配體、白介素-6 和白介素-8 等,在血小板存儲(chǔ)過(guò)程中不斷積累,在其活化后會(huì)參與TRALI等多種輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。

    血小板在TRALI 中的具體作用機(jī)制一直存在疑問(wèn)。 目前的研究表明血小板對(duì)TRALI 的致病過(guò)程具有促進(jìn)作用。 采用用大劑量阿司匹林或血小板膜糖蛋白(GP)IIb、IIIa 抑制劑,阻斷血小板后能有效遏制肺的病理?yè)p傷和死亡。 對(duì)大鼠輸注來(lái)自老化血小板的無(wú)細(xì)胞上清后能夠誘發(fā)嚴(yán)重的TRALI[3-5]。 以上研究均說(shuō)明來(lái)自血小板分泌的可溶性介質(zhì)可能觸發(fā)和推動(dòng)了TRALI的發(fā)生。 存儲(chǔ)的血液制品中的可溶性介質(zhì)主要為具有生物活性的脂質(zhì),對(duì)存儲(chǔ)5 d 后的血小板脂質(zhì)成分分析發(fā)現(xiàn)鞘磷脂神經(jīng)酰胺含量最為豐富,神經(jīng)酰胺主要由鞘磷脂經(jīng)酸性鞘磷脂酶在體內(nèi)進(jìn)行生物合成,是造成TRALI 的關(guān)鍵性物質(zhì)[6]。 因此,本研究推測(cè),儲(chǔ)存后的血小板可能通過(guò)酸性鞘磷脂酶增加神經(jīng)酰胺的形成而誘導(dǎo)抗體非依賴性TRALI 的發(fā)生。

    為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè),本研究首先LPS 預(yù)刺激小鼠后,輸注含有酸性鞘磷脂酶特異性抑制劑ARC39或酸性鞘磷脂酶特異性基因缺失的老化血小板構(gòu)建TRALI 的二次打擊模型,分析血小板中的脂質(zhì)成分和肺損傷程度,評(píng)估神經(jīng)酰胺在血小板介導(dǎo)的TRALI 發(fā)病過(guò)程中的具體作用機(jī)制,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選擇近交系 8 ~10 周齡/雄性,SPF 級(jí) BALB/c小鼠,共35 只[SCXK (川) 2018-0032],每只小鼠體重 22~30 g;以及 8 ~10 周齡,SPF 級(jí)酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,Asm)基因敲除小鼠,共35 只[SCXK (川) 2016-0030],每只小鼠體重 22 ~30 g。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)[SYXK(湘)2018-0025]。實(shí)驗(yàn)前1 周所有動(dòng)物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)飼養(yǎng)間,小鼠飼料、飲水及墊料均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化消毒滅菌處理,自由飲水,12 h 晝夜節(jié)律。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容符合中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院大學(xué)動(dòng)物倫理和保護(hù)指南,實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本單位倫理審批(2018HK0342),全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容遵循3R 原則。

    1.2 主要試劑

    LPS(貨號(hào):L2630)購(gòu)自美國(guó) sigma 公司;巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-2 的ELISA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):MM200) 和 腫 瘤 壞 死 因 子-α (TNF-α) (貨 號(hào):MTA00B)購(gòu)買(mǎi)自加拿大R&D 生物公司;凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物 ELISA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):2013-1727)購(gòu)買(mǎi)自上海廣銳生物技術(shù)有限公司;髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):ab144077)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam 公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 血小板的獲取和存儲(chǔ)

    5 只雄性8 周齡BALB/c 小鼠及相同數(shù)量、性別、年齡的Asm基因缺失小鼠經(jīng)麻醉后通過(guò)心臟穿刺收集全血標(biāo)本,全血在室溫下1200 r/min 離心15 min 三次后富集獲得富含血小板血漿并對(duì)其中的血小板進(jìn)行計(jì)數(shù),再以無(wú)菌PBS 溶液將血小板濃度標(biāo)化為終濃度每毫升1×109個(gè),血小板存儲(chǔ)液為10%檸檬酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤混合而成的CPDA 緩沖液,其中一部分添加ASM 抑制劑ARC39(10 mol/L)后在無(wú)菌生物安全柜中存儲(chǔ)。

    1.3.2 小鼠TRALI 的二次打擊模型構(gòu)建及血小板輸注

    BALB/c 小鼠經(jīng)腹腔注射2 mg/kg LPS 或等效體積的生理鹽水,2 h 后經(jīng)尾靜脈緩慢注射10 mL/kg 劑量、濃度為每毫升 1×109個(gè),存儲(chǔ) 1 ~5 d 的BALB/c 小鼠血小板,或添加ASM 抑制劑ARC39 的BALB/c 小鼠血小板,或Asm基因缺失小鼠血小板,對(duì)照組輸注相同體積生理鹽水。 小鼠于室溫下在籠子中觀察6 h。

    1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測(cè)肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)表達(dá)水平。

    處死小鼠后,進(jìn)行氣管插管,肺內(nèi)注射1 mL 無(wú)菌 PBS 溶液后回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BALF),2000 r/min 離心 5 min 去除細(xì)胞獲取上清得到 BALF,檢測(cè) BALF 中TNF-α、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物角和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(macrophage-inflammatory protein 2, MIP-2)水平,大致步驟如下:每孔加入50 μL 樣品稀釋液,然后分別加入相應(yīng)的50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品及各組小鼠樣品,輕輕搖勻,封上膜后室溫孵育2 h;配置好洗液并洗板5 次,將孔中的液體拍打干凈之后,每孔加100 μL 生物素耦聯(lián)抗體,再封上新膜后室溫孵育2 h,洗板5 次,每孔加入100 μL 顯色底物,室溫避光孵育30 min 顯色,每孔加入 100 μL 反應(yīng)終止液,讀取450 nm 和540 nm 的吸光度值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD 值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出方程,并計(jì)算得到相應(yīng)的指標(biāo)濃度。

    1.3.4 肺組織MPO 活性定量檢測(cè)

    分別取各組小鼠的肺組織,在冰上使用勻漿器充分勻漿組織后10000 r/min 離心10 min,收集離心后上清,即為肺組織勻漿液。 依照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟測(cè)定組織勻漿液在480 nm 處的吸光度值,根據(jù)吸光度值計(jì)算不同肺組織的MPO 活性。

    1.3.5 肺組織MPO 活性定量檢測(cè)

    輸注血小板觀察6 h 后頸椎脫臼法處死各組小鼠,取小鼠左肺組織進(jìn)行濕/干重比值測(cè)定:將肺組織置于電子天平上稱(chēng)量總質(zhì)量W1,隨后置于70℃恒溫烘干箱烘干72 h 使其水分完全蒸發(fā)。 再次稱(chēng)量干燥后的組織記錄為W2。 計(jì)算時(shí)采用公式“(濕重)/(干重)×100%=(W1)/(W2)×100%”計(jì)算出數(shù)值。 取右肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后,用樹(shù)膠封固,放在溫箱中烤干后,在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)肺泡或間質(zhì)中性粒細(xì)胞、透明膜、空隙碎片和肺泡間隔增厚等指標(biāo),使用組織學(xué)肺損傷評(píng)分對(duì)肺損傷進(jìn)行分級(jí)。

    1.3.6 血小板脂質(zhì)譜成分分析

    從儲(chǔ)存后的血小板上清液中提取神經(jīng)酰胺并采用液相色譜法進(jìn)行定量測(cè)定,主要步驟如下:將冷凍后的血小板解凍并以3000 r/min 離心15 min,以四氯甲醇萃取收集脂質(zhì)。 采用Q-TOF 6530 質(zhì)譜儀(Agilent Technologies,Waldbron,德國(guó))及串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)鞘磷脂成分進(jìn)行分析,使用Mass Hunter 軟件(Agilent Technologies)進(jìn)行量化處理。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 22.0 及Prism 7.01 (美國(guó)Graph Pad Software 公司)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()”,多組間比較采用單因素方差分析,以Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較,P<0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 伴隨血小板存儲(chǔ)時(shí)間的增加TRALI 肺損傷加劇

    為了明確血小板儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)于TRALI 的影響,本研究對(duì)BALB/c 小鼠進(jìn)行LPS 腹腔注射后,分別輸注存儲(chǔ) 0、1、3、5 d 的血小板。 6 h 后處死小鼠,觀察小鼠肺發(fā)現(xiàn),輸注血小板后小鼠肺出現(xiàn)了嚴(yán)重的特征性損傷。 肺組織病理切片出現(xiàn)了明顯的肺水腫和組織損傷。 濕/干肺重量比值在輸注儲(chǔ)存3、5 d血小板的小鼠中顯著上調(diào)(圖1A)。 BAL 蛋白含量在輸注儲(chǔ)存5 d 血小板的小鼠體內(nèi)增加明顯(圖1A)。 肺 MPO 活性在輸注儲(chǔ)存 1、3、5 d 血小板的小鼠中均顯著上調(diào)超過(guò)1 倍(圖1A)。 HE 染色顯示輸注儲(chǔ)存1、3、5 d 血小板的小鼠肺組織損傷加重(圖1B)。 以上結(jié)果表明,輸注老化的血小板會(huì)導(dǎo)致肺水腫形成、血管屏障衰竭、肺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織病理學(xué)損傷;并且TRALI 的損傷程度與血小板儲(chǔ)存時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。

    2.2 神經(jīng)酰胺隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加在小鼠血小板中的含量增加

    為了明確是否由于血小板中神經(jīng)酰胺可以隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而積累,本研究通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜對(duì)存儲(chǔ)后的血小板樣品中神經(jīng)酰胺成分的定量分析顯示:神經(jīng)酰胺隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)在血小板中不斷增加,存儲(chǔ)第7 天的血小板中神經(jīng)酰胺的含量是第 0 天的 1.6 ~ 2.9 倍(如圖 2 所示)。 以上結(jié)果表明隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)酰胺會(huì)持續(xù)積累,從而加劇小鼠TRALI。

    2.3 ASM 抑制或缺失后,老化血小板介導(dǎo)的TRALI 明顯減弱

    圖1 老化的血小板輸注到LPS 預(yù)刺激后的小鼠體內(nèi)中會(huì)加劇TRALI 的組織病理?yè)p傷Note.A, Ratio of wet weight to dry weight of mice, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue.B, Histopathological photos of HE staining of lung tissue after transfusion of platelets with different storage time.Compared with the normal control group, *P<0.05.Compared with platelet storage group, #P<0.05.Figure 1 The ratio of wet weight to dry weight, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue of mice after transfusion of aged platelets into LPS pre-stimulated mice with different storage time of TRALI

    圖2 不同種類(lèi)的神經(jīng)酰胺隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加在小鼠血小板中的積累Note.The contents of different kinds of ceramides in stored platelet samples were quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Compared with the normal control group, *P<0.05.Compared with platelet storage group, #P<0.05.Figure 2 Accumulation of different kinds of ceramides in mouse platelets with the increase of storage time

    為了進(jìn)一步探討鞘磷脂在老化血小板介導(dǎo)的TRALI 中的具體機(jī)制,本研究通過(guò)兩種不同的途徑阻斷鞘磷脂的生成:藥物抑制鞘磷脂形成(ASM 的抑制劑ARC39 預(yù)處理血小板)和輸注Asm基因缺失小鼠來(lái)源的血小板。 我們觀察到抑制或阻斷鞘磷脂的生成后,肺MPO 活性和肺組織病理學(xué)損傷顯著好轉(zhuǎn),濕/干肺重量比和 BAL 蛋白含量降低(圖3A)。 HE 染色也顯示小鼠肺在輸注Asm基因缺失血小板或ARC39 預(yù)處理后的血小板后顯著改善了肺損傷(圖3B)。

    3 討論

    通過(guò)本項(xiàng)研究,我們發(fā)現(xiàn)存儲(chǔ)后的血小板中累計(jì)產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺是觸發(fā)血小板介導(dǎo)的抗體非依賴性TRALI 的新機(jī)制,特異性的通過(guò)抑制ASM 活性減少神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生能夠明顯減輕TRALI 癥狀,潛在延長(zhǎng)血小板的存儲(chǔ)時(shí)間并增加輸血的安全性,為臨床血制品的存儲(chǔ)開(kāi)辟了新的前景。

    血小板是一種臨床稀缺的血液制品,因此常常需要盡可能延長(zhǎng)其存儲(chǔ)時(shí)間和最大限度的提高其臨床利用率,但是長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的血小板會(huì)增加TRALI 的風(fēng)險(xiǎn)[7]。 我們通過(guò)構(gòu)建小鼠 TRALI 的二次打擊模型,在輸注血小板6 h 后即觸發(fā)TRALI 的特征性臨床表現(xiàn):肺水腫形成、血管屏障衰竭、肺中性粒細(xì)胞積聚和肺組織學(xué)損傷,并且發(fā)現(xiàn)TRALI 病情的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)血小板的儲(chǔ)存時(shí)間的依賴性。既往的研究已經(jīng)證明神經(jīng)酰胺是內(nèi)皮屏障失效和肺損傷的重要介質(zhì)。 在肺組織和細(xì)胞中鞘脂類(lèi)相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá)量非常高,當(dāng)機(jī)體受到諸如腫瘤壞死因子-α 和血小板活化因子等刺激時(shí),支氣管肺泡灌洗液中酸性鞘磷脂酶的活性增高,神經(jīng)酰胺量也相應(yīng)增加。 并且ASMase 的活性與神經(jīng)酰胺量的同步增加,而應(yīng)用ASMase 抑制劑后,神經(jīng)酰胺的生成顯著減少,肺功能得到了改善[8-9]。 神經(jīng)酰胺通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性增加肺內(nèi)皮細(xì)胞通透性,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流以及內(nèi)皮屏障破壞和肺水腫形成[10-12]。 此外,神經(jīng)酰胺可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而進(jìn)一步加重肺中的內(nèi)皮屏障破壞[13-15]。 我們通過(guò)鞘磷脂成分分析發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的血小板中神經(jīng)酰胺的含量增加最為顯著,提示在TRALI 的致病過(guò)程中,神經(jīng)酰胺可能發(fā)揮重要作用,進(jìn)一步通過(guò)ASM 抑制劑或輸注ASM 基因缺陷小鼠來(lái)源的血小板可以明顯緩解TRALI 癥狀。因此,我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)神經(jīng)酰胺可能是血小板介導(dǎo)的抗體非依賴性TRALI 的重要分子,而且靶向抑制ASM 依賴的神經(jīng)酰胺的形成可以降低老化血小板介導(dǎo)ALI 的風(fēng)險(xiǎn),從而增加儲(chǔ)存血液制品的安全性。

    圖3 輸注Asm 基因缺失小鼠來(lái)源的血小板或ASM 特異性抑制劑處理后的儲(chǔ)存血小板可明顯減弱減弱TRALI 損傷Note.A.Ratio of lung wet weight to dry weight, the protein concentration in BAL and the activity of MPO in lung tissue of each group of mice were marked as shown in the figure.B, HE staining tissue sections of the lungs of each group of mice。 Compared with the normal control group, *P<0.05.Compared with platelet transfusion group, #P<0.05.Figure 3 Transfusion of platelets derived from Asm gene deleted mice or stored platelets treated with ASM specific inhibitors could significantly attenuate TRALI damage

    在早期研究中,通過(guò)輸注針對(duì)小鼠血小板的兔多克隆血清耗竭血小板或者高劑量阿司匹林可以有效遏制TRALI 的發(fā)生發(fā)展。 我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):這種高劑量的阿司匹林僅能降低TRALI 小鼠的死亡率,而在藥理學(xué)劑量(10 mg/Kg)下并沒(méi)有觀察到保護(hù)作用。 鑒于阿司匹林對(duì)COX-1 有抑制作用,這表明大劑量阿司匹林的保護(hù)作用可能源于其血小板非依賴性的抗炎和抗氧化特性,或來(lái)自代謝衍生物水楊酸鹽的特性,而不是其抗血小板活性。 此外,臨床上血小板常規(guī)的存儲(chǔ)時(shí)間為3 ~5 d,在美國(guó)基于預(yù)防細(xì)菌污染的考慮,血小板存儲(chǔ)時(shí)間限定在5 d 以內(nèi)[16]。 在本研究中,靶向抑制 ASM 活性,不僅能夠緩解輸注存儲(chǔ)5 d 的血小板之后的TRALI 癥狀,并且可成功將小鼠血小板的儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d,有助于提高臨床血小板使用率,緩解血制品的供需矛盾。

    猜你喜歡
    神經(jīng)酰胺儲(chǔ)存抑制劑
    神經(jīng)酰胺代謝紊亂在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用
    神經(jīng)酰胺在心血管疾病預(yù)測(cè)價(jià)值中的研究進(jìn)展
    神經(jīng)酰胺與肥胖相關(guān)疾病防治的研究進(jìn)展
    安防云儲(chǔ)存時(shí)代已來(lái)
    凋亡抑制劑Z-VAD-FMK在豬卵母細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用
    冬眠
    組蛋白去乙酰化酶抑制劑的研究進(jìn)展
    磷酸二酯酶及其抑制劑的研究進(jìn)展
    火電廠碳捕集與儲(chǔ)存中吸收法的應(yīng)用和改進(jìn)
    四種魔芋中神經(jīng)酰胺含量比較研究
    国产精品,欧美在线| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 真人做人爱边吃奶动态| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲第一青青草原| 久久亚洲真实| 大码成人一级视频| 亚洲av片天天在线观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品美女久久av网站| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 日日夜夜操网爽| 手机成人av网站| 亚洲美女黄片视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产亚洲欧美98| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成在线人永久免费视频| 国产麻豆成人av免费视频| 人人澡人人妻人| 麻豆成人av在线观看| 国产又爽黄色视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产单亲对白刺激| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费看a级黄色片| 岛国视频午夜一区免费看| videosex国产| 日本欧美视频一区| 麻豆成人av在线观看| 亚洲美女黄片视频| 一进一出好大好爽视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 亚洲在线自拍视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久午夜亚洲精品久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费少妇av软件| 色在线成人网| 国产91精品成人一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 午夜亚洲福利在线播放| www.www免费av| 免费在线观看亚洲国产| 欧美中文日本在线观看视频| 女人精品久久久久毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 精品福利观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲欧美激情在线| 成人av一区二区三区在线看| 大型黄色视频在线免费观看| 国产不卡一卡二| 99re在线观看精品视频| 国产精品 欧美亚洲| www国产在线视频色| 人妻久久中文字幕网| 欧美久久黑人一区二区| 久久精品国产综合久久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 身体一侧抽搐| 神马国产精品三级电影在线观看 | 性欧美人与动物交配| 亚洲男人的天堂狠狠| 人人澡人人妻人| 女性被躁到高潮视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲人成77777在线视频| 精品无人区乱码1区二区| 看黄色毛片网站| 97碰自拍视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 老司机福利观看| 岛国在线观看网站| 欧美一区二区精品小视频在线| av视频免费观看在线观看| 在线天堂中文资源库| 成在线人永久免费视频| 两个人视频免费观看高清| 99riav亚洲国产免费| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美中文综合在线视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 黑人操中国人逼视频| 久久香蕉精品热| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜a级毛片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 18禁美女被吸乳视频| 后天国语完整版免费观看| 色av中文字幕| 精品国产国语对白av| 国产野战对白在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲电影在线观看av| 99国产精品免费福利视频| 男人操女人黄网站| 丝袜美足系列| 国产主播在线观看一区二区| a在线观看视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲全国av大片| 国产91精品成人一区二区三区| 满18在线观看网站| 久9热在线精品视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | av在线播放免费不卡| 国产精品一区二区三区四区久久 | 深夜精品福利| 亚洲七黄色美女视频| 制服诱惑二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品福利观看| 成人免费观看视频高清| 欧美中文综合在线视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 天天添夜夜摸| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲电影在线观看av| 女性生殖器流出的白浆| www国产在线视频色| 欧美精品亚洲一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 操美女的视频在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品,欧美在线| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲,欧美精品.| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩有码中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久久人人做人人爽| 麻豆国产av国片精品| 午夜日韩欧美国产| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久国产成人免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久亚洲精品不卡| 中国美女看黄片| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲少妇的诱惑av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产伦一二天堂av在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 91麻豆av在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 校园春色视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美另类亚洲清纯唯美| 超碰成人久久| 女同久久另类99精品国产91| 日韩免费av在线播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久久久久久大奶| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲精品国产区一区二| 久热这里只有精品99| or卡值多少钱| 国产av又大| www.精华液| 国产成+人综合+亚洲专区| 身体一侧抽搐| 18禁国产床啪视频网站| 69av精品久久久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日本欧美视频一区| cao死你这个sao货| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 色老头精品视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品久久电影中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 搡老岳熟女国产| 精品久久久久久久毛片微露脸| 一本久久中文字幕| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 黑人操中国人逼视频| 亚洲专区中文字幕在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲黑人精品在线| 首页视频小说图片口味搜索| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 人成视频在线观看免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产精品av久久久久免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 激情在线观看视频在线高清| 美女国产高潮福利片在线看| 久久热在线av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一本大道久久a久久精品| 国产精品 欧美亚洲| 69精品国产乱码久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲自拍偷在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产伦一二天堂av在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人av教育| 欧美成狂野欧美在线观看| cao死你这个sao货| 久久久久久大精品| 久久久久久久午夜电影| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品一区av在线观看| 国产视频一区二区在线看| 一本大道久久a久久精品| xxx96com| 人妻久久中文字幕网| 老司机午夜福利在线观看视频| 操美女的视频在线观看| 午夜精品在线福利| 午夜福利在线观看吧| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲国产精品999在线| 男人舔女人的私密视频| 久久精品91蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 1024视频免费在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 黄色视频不卡| 午夜免费观看网址| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 脱女人内裤的视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产成人影院久久av| 国产高清有码在线观看视频 | 男女午夜视频在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆成人av在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 亚洲视频免费观看视频| 午夜免费观看网址| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美精品亚洲一区二区| 麻豆一二三区av精品| 国产麻豆69| 国产欧美日韩一区二区精品| 波多野结衣一区麻豆| 午夜精品在线福利| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 在线观看免费日韩欧美大片| 精品久久久久久成人av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲成人国产一区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| www国产在线视频色| 天天一区二区日本电影三级 | 欧美日韩福利视频一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 婷婷丁香在线五月| 国内精品久久久久精免费| 国产精品免费视频内射| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 日本在线视频免费播放| 一级毛片高清免费大全| 久久婷婷成人综合色麻豆| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 日本在线视频免费播放| 成人国产综合亚洲| 国产高清视频在线播放一区| 在线天堂中文资源库| www.www免费av| 日本在线视频免费播放| 女性被躁到高潮视频| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩免费av在线播放| 国产精品二区激情视频| 亚洲人成电影观看| 国产av一区在线观看免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产不卡一卡二| 制服丝袜大香蕉在线| 精品无人区乱码1区二区| 麻豆一二三区av精品| 嫩草影视91久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 色精品久久人妻99蜜桃| 久久影院123| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 麻豆国产av国片精品| 丁香六月欧美| 精品人妻1区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产97色在线日韩免费| 色播在线永久视频| 午夜福利18| 日日干狠狠操夜夜爽| 性欧美人与动物交配| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久国产精品人妻蜜桃| 悠悠久久av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲人成伊人成综合网2020| 岛国在线观看网站| av中文乱码字幕在线| 视频区欧美日本亚洲| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费观看精品视频网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利一区二区在线看| 一级,二级,三级黄色视频| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩精品网址| 88av欧美| 一进一出抽搐动态| 精品国产国语对白av| 亚洲精品一区av在线观看| а√天堂www在线а√下载| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人欧美| 91成年电影在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成人久久性| 久久精品影院6| 国产欧美日韩一区二区精品| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 老司机靠b影院| 国产av精品麻豆| 久久久国产成人精品二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲专区中文字幕在线| 国产伦人伦偷精品视频| av天堂久久9| 精品国产亚洲在线| 日韩三级视频一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 无限看片的www在线观看| 久久亚洲精品不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 无遮挡黄片免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲国产看品久久| www.www免费av| 一区二区三区国产精品乱码| 成人三级黄色视频| a级毛片在线看网站| 国产激情欧美一区二区| 自线自在国产av| 亚洲av熟女| 精品第一国产精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 少妇 在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 日本欧美视频一区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 最新在线观看一区二区三区| 老司机靠b影院| 免费人成视频x8x8入口观看| 9色porny在线观看| 午夜免费成人在线视频| 在线观看午夜福利视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 无人区码免费观看不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美丝袜亚洲另类 | 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看www视频免费| 99国产综合亚洲精品| 久久久久久久久免费视频了| 无遮挡黄片免费观看| 一区在线观看完整版| 色老头精品视频在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 在线av久久热| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女午夜性视频免费| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美大码av| 欧美av亚洲av综合av国产av| av福利片在线| 国产乱人伦免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品一区av在线观看| 一本久久中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| videosex国产| xxx96com| 欧美黑人精品巨大| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一二三四在线观看免费中文在| 91成年电影在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产高清激情床上av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 中文亚洲av片在线观看爽| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩视频一区二区在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产乱人伦免费视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 我的亚洲天堂| 久热这里只有精品99| aaaaa片日本免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 啪啪无遮挡十八禁网站| 岛国在线观看网站| 日韩欧美免费精品| 99精品在免费线老司机午夜| 午夜a级毛片| 成年女人毛片免费观看观看9| 少妇粗大呻吟视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲专区国产一区二区| 国产av精品麻豆| 一级毛片精品| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲avbb在线观看| 色在线成人网| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色 视频免费看| 亚洲精华国产精华精| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久久久大精品| 午夜免费鲁丝| 宅男免费午夜| 日本在线视频免费播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产麻豆69| 精品电影一区二区在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 国语自产精品视频在线第100页| 制服丝袜大香蕉在线| 咕卡用的链子| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久青草综合色| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 男女午夜视频在线观看| 久久这里只有精品19| 99国产极品粉嫩在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 夜夜爽天天搞| 又黄又爽又免费观看的视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美黑人精品巨大| 老司机福利观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看免费午夜福利视频| 一级a爱视频在线免费观看| 大型av网站在线播放| 天天一区二区日本电影三级 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 又大又爽又粗| 免费无遮挡裸体视频| 国产高清有码在线观看视频 | 久久香蕉国产精品| 日韩欧美在线二视频| 啦啦啦免费观看视频1| 中出人妻视频一区二区| 国产三级在线视频| 免费不卡黄色视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲熟女毛片儿| 成年人黄色毛片网站| 妹子高潮喷水视频| 69av精品久久久久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一a级毛片在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产一区二区三区综合在线观看| 黄片播放在线免费| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久久久久免费视频了| 99在线人妻在线中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 啦啦啦 在线观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一本综合久久免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久久久大精品| 韩国av一区二区三区四区| 免费看美女性在线毛片视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费高清在线观看日韩| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲av熟女| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲成av人片免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 美女 人体艺术 gogo| 日韩精品青青久久久久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产97色在线日韩免费| 国产成人系列免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产又色又爽无遮挡免费看| √禁漫天堂资源中文www| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 怎么达到女性高潮| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成人永久免费在线观看视频| 黄频高清免费视频| 一本综合久久免费| 久久久久久久精品吃奶| 午夜两性在线视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久狼人影院| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| av视频免费观看在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久水蜜桃国产精品网| 热re99久久国产66热| 午夜福利免费观看在线| 成人永久免费在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频 | 性色av乱码一区二区三区2| av免费在线观看网站| 久久香蕉激情| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人av教育| 国产在线观看jvid| 高清在线国产一区| 长腿黑丝高跟| 久久精品国产综合久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一级a爱视频在线免费观看| 99riav亚洲国产免费| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久国产成人精品二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| www.精华液| 免费在线观看完整版高清| 窝窝影院91人妻| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 麻豆成人av在线观看| 在线观看日韩欧美| 午夜视频精品福利| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产在线观看jvid| 午夜久久久久精精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日本视频| 免费搜索国产男女视频| 国产99白浆流出| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲 国产 在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线观看一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡|