真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌細胞保護的自噬機制研究

黃 劍馬曉彤張亞杰李麗靜韓 冬劉 佳

(長春中醫(yī)藥大學藥學院,長春 130117)

心力衰竭又叫充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF),現(xiàn)代醫(yī)學研究表明,CHF 是心臟無法滿足機體代謝所需要的血量進而引起的以循環(huán)功能障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,包含身體多個方面改變,最終出現(xiàn)心功能失代償,出現(xiàn)心力衰竭的癥狀[1]。 CHF 屬于中醫(yī)證候中的心腎陽虛證,其具有本虛標實的特點,表現(xiàn)為脾氣虛、肺氣虛、腎氣虛和肝氣虛,以水停血瘀、陽虛水泛為發(fā)病機制,以上表現(xiàn)屬《傷寒論》中的真武湯證,應(yīng)以真武湯加以治療。 臨床研究表明真武湯可以輔助西藥進行慢性心力衰竭治療,可以輔助西藥逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu),提高心臟供血能力,改善心力衰竭患者心功能[2-3]。 因此,本實驗依據(jù)真武湯對心肌的保護作用,通過注射阿霉素建立心腎陽虛型心力衰竭大鼠模型,研究大鼠接受真武湯前后對心腎陽虛型心力衰竭大鼠行為體征、血流動力學以及相關(guān)自噬過程中蛋白表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康2 月齡SPF 級SD 雄性大鼠70 只,體重260～280 g 購自遼寧省長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)-2016-0001]。 甲狀腺切除手術(shù)于長春中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥理實驗室[SYXK(吉)2016-0017]進行。 動物實驗及操作流程嚴格遵守3R 原則,動物實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學倫理委員會審查批準(20190051)。 動物飼養(yǎng)于清潔級動物室,室溫為25℃,相對濕度為50%～70%,飼喂大鼠維持飼料,自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

注射用鹽酸多柔比星(161108),購置于山西普德藥業(yè)股份有限公司；芪藶強心膠囊(20160412),購置于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；大鼠BNP、LA、CaN、TSH、T3、T4 試劑盒購置于上海源葉生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、Western 洗滌液、SDS-PAGE 電泳液(干粉)、 ECL 發(fā) 光 液 購 置 于 中 國 wanleibio；LC3( WL01506 )、 BECLIN 1 ( WL02508 )、 P62(WL02385)、ATG5(WL02411)、羊抗兔IgG-HRP(WLA023)、內(nèi)參抗體β-actin(WL01372)購置于中國wanleibio；辣根酶標記鏈酶親合素購置于中國碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊血清、DAB 顯色液購置于中國Solarbio。

電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；臺式低溫高速離心機(上海飛鴿儀器廠)；酶標儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)；水平搖床(北京六一)；電泳裝置(北京六一)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)；石蠟切片機(德國Leica 公司)；顯微鏡(日本OLUMPUS 公司)；16 道生理記錄儀(美國Biopac 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模及分組

腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)麻醉大鼠,BL-420F 生物信號采集分析系統(tǒng)記錄胸前導聯(lián)或II 導聯(lián)心電圖[4],篩選并棄去ST 段有異常變化者和心律失常者。 本實驗動物模型的建立,參考中醫(yī)證候心腎陽虛證以及吳向東[5]用大鼠建立的該種證候動物模型并改進。 取符合要求的健康SPF 級的雄性SD 大鼠70 只,隨機分為正常組(Control,10 只)、模型組(CHF,60 只)。 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg),麻醉后摘除雙側(cè)甲狀腺。 空白對照組行假手術(shù)。 術(shù)后第15 天起,模型組大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素(4 mg/kg),空白對照組注射等劑量生理溶液,每周注射1 次,持續(xù)5 周。 術(shù)后第35 天將存活下來模型組動物再次隨機分為5 組,即模型對照組(CHF)、芪藶強心膠囊組(QL,0.37 g/kg)、真武湯高劑量組(ZWG,1.35 g/kg)、真武湯中劑量組(ZWZ,0.81 g/kg)、真武湯低劑量組(ZWD,0.41 g/kg)各12 只。 次日灌胃相應(yīng)藥物,空白對照組和模型對照組灌胃蒸餾水,連續(xù)10 d。

1.3.2 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠一般情況影響

給藥后每周測定大鼠體溫、體重,詳細記錄進食數(shù)量和飲水情況。

1.3.3 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

稱取大鼠體重,處死后,迅速取出心臟組織,以生理鹽水清洗,稱取心臟重量,公式如下:CWI=大鼠心臟重量/大鼠體重×100%。

1.3.4 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠血流動力學影響

第10 天給藥完畢30 min 后,打開已定標好的十六道生理記錄儀及軟件后,以20%烏拉坦0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠,通過十六導系統(tǒng),觀察并記錄各組左室最大上升速率(+dp/dtmax)、左室最大下降速率(-dp/dtmax)等指標的變化情況。

1.3.5 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠血清T3、T4和TSH 含量影響

大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,平均麻醉劑量為30 mg/kg,等待大鼠被麻醉后,用手術(shù)剪切開動物的腹腔,迅速地剪斷股動脈,進行采血,最后分離血清,使用大鼠T3、T4、TSH 的ELISA 試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)測定大鼠血清中T3、T4、TSH 含量[6]。

1.3.6 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌細胞BNP、LA 和CaN 含量影響

取心肌組織,加入適量的蛋白萃取劑,心肌組織標本勻漿化。 300 r/min,離心20 min。 收集上清。 同上述檢測方法類似,經(jīng)過稀釋、加樣、溫育、洗滌等步驟,通過標準曲線回歸分析計算濃度。

1.3.7 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、P62 蛋白表達影響

稱取心肌組織,通過全蛋白提取試劑盒(中國wanleibio) 進行組織勻漿,低溫離心(4℃,12000 r/min,10 min)分離上清得到蛋白質(zhì)抽提物。 通過BCA 蛋白濃度測定試劑盒(中國wanleibio)測定蛋白含量。 加入20 μL 樣品并在10%及15%聚丙烯酰胺凝膠上分離。 轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,用相應(yīng)的抗體探測。 使用對應(yīng)的免疫球蛋白試劑通過凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B 型,北京六一)觀察印跡,用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer 軟件)分析目標條帶的光密度值。

1.3.8 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和P62 表達影響

固定后的心肌組織依次進行包埋、透蠟、切片、抗原包被等程序,封片后于顯微鏡40×10 觀察染色效果并拍照。

1.3.9 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織病理變化的影響

固定后的心肌組織進行脫水、透明、包埋、切片、染色等程序,封片后于顯微鏡40×10 下觀察染色效果并拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件,進行多組間差別用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行統(tǒng)計,組間兩兩比較用方差分析后的LSD 檢驗。 實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差()表示,檢驗結(jié)果以P＜0.05 為具有統(tǒng)計學意義,P＜0.01 為統(tǒng)計學有明顯統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠一般情況影響

2.1.1 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠自然情況影響

各給藥組和模型對照組比較狀態(tài)較好,活動較自如,癥狀有了明顯改善,飲食、飲水基本恢復(fù)正常,皮毛相對柔順而略有光澤,顏色由黃變淡,體重下降不明顯,精神狀態(tài)良好,較為活潑好動,生命體征總體好于模型對照組,結(jié)果見表1。

2.1.2 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠體重、體溫的影響

CHF 大鼠在造模后,體重下降趨勢顯著,與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),雖然芪藶強心膠囊和真武湯高中劑量可以改善體重的降低,但并無明顯差別(P＞0.05)。 體溫也隨著靜脈注射阿霉素時間的增加有所下降,但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),結(jié)果見表2。

2.1.3 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

與空白組相比,心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟心臟指數(shù)雖有所增加,但無明顯變化(P＞0.05),結(jié)果見表3。

2.2 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠血流動力學的影響

血流動力學方面,模型對照組與空白對照組比較±dp/dpmax 變化十分明顯(P＜0.01),+dp/dpmax下降至空白對照組值的35.5%,說明造模成功[7]。芪藶強心膠囊和真武湯各劑量都能夠顯著抑制±dp/dpmax 變化(P＜0.05),說明真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌的收縮和舒張功能均有明顯改善作用,結(jié)果如表4。

2.3 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠血清T3、T4、TSH 含量的影響

除空白組外,T4的含量均較低(P＜0.05),說明甲狀腺清除完整,各給藥組可提高血清中T4含量,證明各給藥組可以改善心腎陽虛型CHF 大鼠甲狀腺功能；造模后大鼠血清TSH 的含量高于空白組(P＜0.05)。 證明造模后甲狀腺功能降低,機體需要通過增加TSH 來刺激T4產(chǎn)生。 結(jié)果見表5。

2.4 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌BNP、LA、CaN 含量的影響

與正常組比較,心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LA 水平有所降低(P＜0.05),CaN、LA 含量有所升高(P＜0.05),而各給藥組均可對三個指標具有不同程度調(diào)節(jié)作用,其中高劑量組作用最強(P＜0.05 或P＜0.01),結(jié)果見表6。

表1 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠自然情況影響(n=10)Table 1 Physiological state of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups體重(g)Weight體溫(℃)Body temperature正常組Control 304.43±17.78* 38.47±0.17模型對照組CHF 248.40±32.80 37.42±0.50芪藶強心膠囊組QL 275.24±57.30* 37.08±0.62真武湯高劑量組ZWG 248.67±32.01* 37.00±0.33真武湯中劑量組ZWZ 251.62±56.30* 36.97±0.66真武湯低劑量組ZWD 209.61±19.33* 37.45±1.18

表3 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表3 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05。Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量Dose心臟指數(shù)(g/kg)CWI正常組Control —— 2.6726±0.2064模型對照組CHF —— 2.8408±0.7152芪藶強心膠囊組QL 0.30 g/kg 2.8143±0.3638真武湯高劑量組ZWG 1.35 g/kg 2.9043±0.1667真武湯中劑量組ZWZ 0.81 g/kg 3.3972±0.1171*真武湯低劑量組ZWD 0.41 g/kg 3.0415±0.3002

表4 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血流動力學影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表4 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血流動力學影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose左室最大上升速率(mmHg/s)+dp/dtmax左室最大下降速率(mmHg/s)-dp/dtmax正常組Control —— 5234.86±187.02** -5219.60±194.21**模型對照組CHF —— 1859.85±163.13 -1764.93±182.27芪藶強心膠囊組QL 0.30 3786.41±181.17** -3577.87±128.38**真武湯高劑量組ZWG 1.35 2943.28±153.96** -2839.27±173.52**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2441.53±149.23* -2521.64±160.86*真武湯低劑量組ZWD 0.41 2236.41±110.46 -2377.87±128.38

2.5 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白的影響

Western blot 結(jié)果表明,與對照組比較,心腎陽虛模型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、BECLIN1 水平明顯降低,而各給藥組均能提高大鼠心肌組織中LC3、ATG5、BECLIN1 蛋白表達量。 與對照組比較,心腎陽虛模型CHF 大鼠心肌P62 水平變化不大,但各給藥組均能降低P62 蛋白表達量,其中真武湯各組降低作用明顯,結(jié)果見圖1,由左至右依次為正常組,模型對照組,芪藶強心膠囊組,真武湯高、中、低劑量組,詳見表7。

表5 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表5 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05。Note.Compared with the model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose三碘甲腺原氨酸T3(nmol/L)血清總甲狀腺素T4(nmol/L)促甲狀腺激素TSH(nmol/L)正常組Control — 0.04±0.01 0.75±0.09* 0.68±0.16*模型對照組CHF — 0.05±0.01 0.51±0.01 0.80±0.12芪藶強心膠囊組QL 0.30 0.05±0.02 0.55±0.00* 0.82±0.09*真武湯高劑量組ZWG 1.35 0.05±0.01 0.57±0.02* 0.85±0.17真武湯中劑量組ZWZ 0.81 0.04±0.02 0.55±0.05* 0.83±0.19真武湯低劑量組ZWD 0.41 0.03±0.01 0.53±0.00* 0.83±0.19

表6 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表6 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose乳酸LA(nmol/L)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CaN(nmol/L)腦鈉肽BNP(nmol/L)正常對照組Control - 16.96±0.76* 1.35±0.30* 1.07±0.22*模型對照組CHF - 16.30±0.37 1.83±0.29 1.31±0.22芪藶強心膠囊組QL 0.30 17.96±1.88* 1.45±0.30* 0.91±0.38*真武湯高劑量組ZWG 1.35 16.85±0.70* 1.33±0.29** 0.96±0.25**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 16.57±0.57 1.49±0.25* 1.02±0.25**真武湯低劑量組ZWD 0.41 16.33±0.67 1.55±0.21* 1.26±0.24

表7 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

表7 真武湯對心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

注:與模型對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

組別Groups 劑量(g/kg)Dose LC3 ATG5 Beclin1 P62正常對照組Control - 1.00±0.00*** 1.00±0.00*** 1.00±0.00* 1.00±0..00*模型對照組CHF - 0.66±0.11 0.71±0.23 0.95±0.07 1.13±0.18芪藶強心膠囊組QL 0.30 1.80±0.13*** 1.69±0.23*** 1.70±0.21*** 0.97±0.13*真武湯高劑量組ZWG 1.35 2.77±0.15*** 1.73±0.24*** 1.73±0.18*** 0.81±0.24**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2.83±0.13*** 2.01±0.23*** 1.20±0.22** 0.68±0.16***真武湯低劑量組ZWD 0.41 2.52±0.12*** 2.02±0.28*** 1.73±0.14*** 0.81±0.17***

圖1 心肌組織LC3(a)、ATG5(b)、BECLIN1(c)、P62(d)表達結(jié)果Figure 1 Results of LC3 (a), ATG5 (b), BECLIN1 (c), P62 (d) in myocardial tissue

2.6 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和p62 表達影響

免疫組織化學染色結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型對照組心肌BECLIN1、P62 表達量降低,各給藥組可以升高心腎陽虛型CHF 導致的P62 表達量的降低,見圖2。

2.7 真武湯對心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織影響

HE 染色結(jié)果可見:空白對照組心肌纖維間連接密集、纖維間分布平整,細胞與細胞之間距離正常；模型對照組心肌細胞邊緣不整,大面積心肌纖維溶斷,細胞間距加寬,心肌纖維排列混亂,存在局部炎性細胞浸潤現(xiàn)象,心肌組織產(chǎn)生局部水腫；各給藥組可使模型對照組的心肌細胞得到好的治療改善,結(jié)果見圖3。

3 討論

慢性心力衰竭中醫(yī)證型分類方式繁多各有側(cè)重,目前還沒有統(tǒng)一的標準。 相對比較權(quán)威的《中醫(yī)新藥臨床研究指導原則》[8]辯證標準將本病分為7 個證型。 疾病的初期病理變化是心肺氣虛。 病情進一步進展則是氣陰兩虧、氣虛血疲。 而慢性心力衰竭較嚴重的階段則是心腎陽虛、陽虛水泛、痰飲阻肺。 在實驗的過程中,我們通過手術(shù)將實驗用大鼠兩側(cè)甲狀腺切除,再對它進行尾部靜脈注射阿霉素之后,實驗大鼠主要表現(xiàn)出毛皮灰黃、呼吸微弱、精神萎靡、畏寒蜷縮、大便溏瀉的癥狀,這些生命體征與人類中醫(yī)證候心腎陽虛證型非常相像[9]。 基源于此,我們認為這組大鼠的表現(xiàn)與模擬的心腎陽虛證候十分吻合,根據(jù)上述研究內(nèi)容,我們在建立心腎陽虛證的動物模型時,可以參考上述方案。

圖2 免疫組化檢查結(jié)果Note.A, Control.B, Model.C, QL.D, ZWG.E, ZWZ.F, ZWD.Compared with the model group, ***P＜0.001.Figure 2 Results of IHC

圖3 光鏡檢查結(jié)果Figure 3 Results by light microscopy

經(jīng)過大量的臨床和動物實驗已經(jīng)證實,阿霉素在長期應(yīng)用時可出現(xiàn)難以恢復(fù)的心臟毒性作用,而且由于阿霉素與心肌組織親和力顯著強于其他組織,因此可出現(xiàn)劑量不可逆的依賴性心肌損傷[10],可能與其機制相關(guān)的因素有:基因突變[10-11]；核酸、脂質(zhì)過氧化[12]；Ca2+超載[13]；能量代謝障礙[14-15]；自由基損傷[16]；產(chǎn)物的直接性損害[17]等。 目前,腹腔間斷性注射阿霉素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于慢性心力衰大鼠模型的建立[18-19],并被認為能夠高度模仿人體慢性心力衰竭的神經(jīng)-內(nèi)分泌機制和血流動力學的改變,與其它造模方法相比,該法具有方法簡單和復(fù)制性高的優(yōu)點。 因此本研究認為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽抗心衰的治療性研究。

本研究結(jié)果顯示,真武湯可以降低心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌組BNP 含量,說明其對心衰癥狀具有改善功能。 LA 作為運動時物質(zhì)代謝的產(chǎn)物,模型動物LA 含量降低說明心肌細胞功能下降,而真武湯能夠升高心肌組織LA 含量,降低CaN 含量,說明真武湯能夠改善心臟能量代謝。 心腎陽虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5、BECLIN1含量降低,P62 含量升高,說明心力衰竭初期心肌細胞有大量細胞發(fā)生自噬,真武湯可以升高心力衰竭大鼠自噬相關(guān)指標LC3、ATG5、BECLIN1 含量,降低P62 含量,說明真武湯在心力衰竭初期可以通過調(diào)節(jié)自噬保護損傷的心肌細胞。

綜上所述,在進行有關(guān)針對心腎陽虛型CHF 模型的構(gòu)建的研究時,可以應(yīng)用阿霉素尾靜脈注射的方法,本研究認為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽抗心衰的治療性研究,并且,在臨床中針對本有不同程度符合心腎陽虛證型的慢性心力衰竭的患者,可以加以應(yīng)用真武湯進行辨證論治。