野生蔓越莓活悅飲的制備及其體內(nèi)抗氧化功能研究

石 杰，李寶龍， 劉宇峰，王嬌嬌，段婷婷，董 艷

（1. 黑龍江省科學院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

0 引言

野生蔓越莓（Vaccinium Vitis-idaeaL.） 屬于杜鵑花科越橘屬植物，又名牙疙瘩、紅豆、紅果，分布于東亞、北美、北歐的高山地帶[1-2]。通過查閱中華藥典，根據(jù)藥性相生相克研制出了針對女性日常引用的功能飲品——野生蔓越莓活悅飲。以野生蔓越莓凍果榨汁去果膠為基礎飲料，將野生蔓越莓與馬來西亞國寶——卡琪花蒂瑪、紅花、枸杞提取物進行配伍，輔以蔗糖、木糖醇或三氯蔗糖制備而成的功能型無醇果汁飲品，不添加任何防腐劑，具有濃郁的蔓越莓果香和酸甜清涼的草本口味，色澤紅潤明亮、質(zhì)量穩(wěn)定、口感爽滑細膩、營養(yǎng)價值高，具有增強女性免疫能力、改善內(nèi)分泌紊亂、提高女性性功能、提神醒腦、預防婦科炎癥、細膚美顏等作用。

1 材料與試劑

1.1 野生蔓越莓活悅飲的制備

野生蔓越莓，大興安嶺冰莓莊園生物發(fā)展有限公司提供；紅花、枸杞，購買于藥店；卡琪花蒂瑪?shù)母稍锔~，購買于馬來西亞；果膠酶、礦泉水，均為食品級。

1.2 飲料抗氧化性試驗

試驗動物：SPF 級ICR 小鼠60 只，遼寧長生生物技術有限公司提供，試驗動物許可證號：SCXK（遼） 2015- 0001。

試驗條件：黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心（屏障環(huán)境），許可證號：SYXK （黑） 2016- 004，溫度21～25℃，濕度40%～70%。SPF 級試驗動物飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號：SCXK（京） 2014- 0010。

1.3 急性、毒性研究

（1） 受試物。野生蔓越莓活悅飲（原花青素含量為4.629 66 mg/mL），溶于水，穩(wěn)定。供試品采用蒸餾水配制，配制頻率為試驗當天配制1 次，配制提供樣品的3 倍濃縮液。

（2） 試驗動物。Wistar 大鼠，SPF 級，雌雄各半，共20 只，初始體重范圍為90～100 g，使用時體重范圍118.5～129.0 g，遼寧長生生物技術股份有限公司提供（動物合格證號： SCXK- （遼） 2015-0001）。動物購入后，首先進行預分籠，給一個臨時預分號并測定購入日體重。從購入日算作第1 天，檢疫與馴化期共為7 d。期間對于外觀、狀態(tài)出現(xiàn)異常，可能對試驗有影響的動物在試驗時剔除[3]。分組方法：雌、雄動物禁食16 h 后分別按體重分組；識別方法：檢疫馴化期采用尾部標記動物編號，正式試驗采用皮毛標記編號，并在籠具上標明試驗研究號、組別、性別及籠號。

（3） 試驗動物飼養(yǎng)管理的環(huán)境條件。飼養(yǎng)室采用屏障系統(tǒng)，溫度設定21～25 ℃，濕度設定40%～70%，換氣次數(shù)10～20 次/ h，晝夜明暗交替時間12/12（6:00～18 :00 采用動物照明控制系統(tǒng)）。

（4） 飼養(yǎng)條件。籠具為PC 聚碳酸酯鼠盒（長×寬× 高= 40 cm×25.5 cm×20 cm），飼養(yǎng)密度5 只/盒，籠具交換2 次/ 周，糞便處理需要更換鼠盒及墊料（周一、周四），每天全部試驗結(jié)束后，由動物室人員進行常規(guī)消毒。

（5） 飼料及飲用水。全價顆粒飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，鈷60 輻照滅菌自由攝取。飲用水采用高壓滅菌自來水，由動物飲水瓶自由攝取，經(jīng)檢測符合城市飲用水標準。

2 儀器與設備

破碎機、超聲波儀、鼓風干燥箱、連續(xù)光譜酶標儀、可見光分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、離心機、組織勻漿器；丙二醛（MDA） 測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH） 測定試劑盒、蛋白質(zhì)羰基測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD） 測定試劑盒、蛋白定量測試盒，均由南京建成生物技術有限公司提供。

3 研究方法

3.1 野生蔓越莓果膠處理試驗

試驗采用單因素試驗設計，設置3 個處理：①野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 常溫過夜；②野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 50 ℃0.5 h + 常溫1 h；③野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 常溫過夜+ 50 ℃1.5 h。觀測果汁澄清度[4]。

3.2 野生蔓越莓活悅飲制備

紅花按照日推薦量為3 g，枸杞按照日推薦量5 g，原花青素按照日推薦量100 mg，野生蔓越莓原花青素含量為0.827 3%，推算后為12 g 進行配比制備。該野生蔓越莓無醇活悅飲日推薦量為25 mL。

3.2.1 紅花提取物的制備

稱取紅花23.16 g，以1∶1 的體積比浸泡于桶裝礦泉水中1 h，于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，收集濾液后以1∶1 的體積比加入桶裝礦泉水于紅花殘渣中，繼續(xù)于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，反復3 次，分別收集濾液和殘渣。

3.2.2 枸杞提取物的制備

稱取枸杞38.60 g，以1∶2 的體積比浸泡于桶裝礦泉水中1 h，于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，收集濾液后以1∶2 的體積比加入桶裝礦泉水于枸杞殘渣中，繼續(xù)于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，反復3 次，分別收集濾液和殘渣。

3.2.3 卡琪花蒂瑪提取物的制備

稱取卡琪花蒂瑪根葉混合物39.70 g，采用泰斯特萬能粉碎機（型號FW100） 進行粉碎，以1∶2 的體積比浸泡于75%的食用酒精中1 h，于65 ℃下超聲處理1 h 后過濾，收集濾液后再以1∶2 的體積比加入75%的食用酒精于殘渣中，繼續(xù)于65 ℃下超聲處理1 h 后過濾，反復5 次，收集濾液共1.5 L。濾液采用上海申勝生物技術有限公司生產(chǎn)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號R201） 進行濃縮，溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速45 r/min。濃縮后體積約為100 mL。置于鼓風干燥箱中50 ℃下風干，獲得提取物固形物，使用研缽磨碎收集。

3.2.4 野生蔓越莓凍果前處理

稱取野生蔓越莓凍果1 403 g，解凍捏碎，按照0.3%的比例加入果膠酶混合過夜，于50 ℃下水浴0.5 h，得果碎混合物[5]。

3.2.5 野生蔓越莓活悅飲原汁的制備

將果膠酶處理后的野生蔓越莓果碎混合物與3.2.1，3.2.2 中收集的紅花、枸杞濾渣混合，加入新鮮洗凈的薄荷葉10 片左右，使用JYZ- V911 型榨汁機加入3.2.1，3.2.2 中收集的紅花、枸杞濾液榨汁約2 L 進行榨汁，分別收集汁液及果渣。向果渣中加入0.8 L 桶裝礦泉水再次榨汁，收集汁液與之前汁液混合，棄去果渣。在汁液中加入7 g 卡琪花蒂瑪提取物固形物粉末混勻，此即為野生蔓越莓活悅飲原汁[6]。

3.2.6 調(diào)配

采用200 目濾布過濾野生蔓越莓活悅飲原汁。原汁按照不同飲用需要分別使用3 個不同糖分添加量及添加方式。

3.3 飲料抗氧化性試驗

3.3.1 D - 半乳糖氧化損傷模型建立

選25～30 g 健康成年小鼠，除空白對照組外，其余動物用D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 腹腔注射造模，注射量為0.1 mL/10 g，每日1 次，連續(xù)造模6 周，取血測MDA，按MDA 水平分組，隨機分為1 個模型對照組和3 個受試樣品劑量組。

3.3.2 劑量設計分組及受試樣品給予時間

試驗設高、中、低3 個劑量組，分別為人體推薦量的5 倍，10 倍和30 倍，即11.023，22.046，66.138 g/kg·bw。準確稱取野生蔓越莓活悅飲混勻定容至20 mL，分別作為高、中、低3 個劑量經(jīng)口給予受試小鼠。另設空白對照組和模型對照組，共5 組，每組12 只?？瞻讓φ战M和模型對照組均給予等容積蒸餾水，試驗小鼠按體重的2%灌胃容積進行灌胃[7]，在給受試樣品的同時，模型對照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D - 半乳糖腹腔注射，每日1 次，連續(xù)灌胃30 d 后處死動物，測血清及肝組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA） 含量、抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH） 含量、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量及抗氧化酶指標中超氧化物歧化酶（SOD） 活力[8]。

3.3.3 丙二醛（MDA） 含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中MDA含量[9]。

①血清（漿） 中MDA 含量。

樣品測試前稀釋倍數(shù).

注：樣本測試前稀釋倍數(shù)= 上清液制備時稀釋倍數(shù) （5 倍）。

②組織中MDA 含量。

待測樣本蛋白濃度（mgprot/ml） .

注：*nmol/mgprot 為納摩爾/ 毫克蛋白。

3.3.4 還原型谷胱甘肽（GSH） 含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中GSH含量[10]。

①血漿中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×樣品測試前稀釋倍數(shù)

注：標準品濃度為20 μmol/L=20×10-6mol/L；樣本測試前稀釋倍數(shù)= 上清液制備時稀釋倍數(shù)（5 倍）。

②組織中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×樣本測試前稀釋倍數(shù)÷

待測勻漿蛋白濃度（gprot/L） .

注：樣本測試前稀釋倍數(shù)= 上清液制備時稀釋倍數(shù) （5 倍）

3.3.5 蛋白質(zhì)羰基含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中蛋白質(zhì)羰基含量[11]。

①血清（漿） 中蛋白質(zhì)羰基含量。

②組織中蛋白質(zhì)羰基含量。

3.3.6 超氧化物歧化酶（SOD） 活力測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中SOD活力[12]。

注：mgprot* 為毫克蛋白數(shù)。

3.3.7 蛋白質(zhì)定量測試（考馬斯亮藍法）

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中蛋白含量[13]。

3.3.8 試驗數(shù)據(jù)處理

用Excel 軟件建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 軟件進行方差分析，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗。計算F 值。F 值＜F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，p≤0.05，再用多個試驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計[14]。

3.4 飲料急性毒性試驗

（1） 灌胃途徑及方法。禁食16 h 后灌胃給予[15]。

（2） 灌胃劑量。設一個劑量組。

劑量設計見表1。

（3） 劑量設計理由。根據(jù)預試驗結(jié)果（按設計劑量未測得LD50），以允許的最大質(zhì)量濃度（10 倍原液濃縮） 及動物最大灌胃容積1 次，7 d 內(nèi)無一死亡，未見毒性反應，進行最大劑量測定。

表1 劑量設計

（4） 灌胃頻率。分組當天給1 次。

（5） 觀察內(nèi)容。觀察動物體重、精神狀態(tài)、毛色、呼吸、自主活動、飲食、二便、口鼻分泌物，以及死亡和恢復的時間等[16]。

（6） 觀察例數(shù)。灌胃后全部試驗動物。

（7） 觀察次數(shù)。灌胃后4 h 內(nèi)連續(xù)觀察，然后每天上下午各觀察1 次，連續(xù)觀察14 d。

（8） 體重測定方法。采用 “BMS420.3 型電子天平（上海卓精產(chǎn)品）” 測定。

（9） 體重測定例數(shù)。灌胃前全部購入動物，灌胃后全部試驗動物。

（10） 體重測定次數(shù)。購入日、動物分組（灌胃第1 天） 時、灌胃后每2 d 各測定1 次。

（11） 解剖方法。動物脫臼處死后，進行解剖。剖檢時對動物外表、全身各臟器進行肉眼觀察。若發(fā)現(xiàn)異常則作組織病理學檢查。

（12） 解剖時間。動物死亡后即刻及整個試驗觀察結(jié)束。

（13） 解剖例數(shù)。灌胃后全部試驗動物。

體重采用Microsoft 公司Excel 軟件進行統(tǒng)計。

4 結(jié)果與分析

4.1 野生蔓越莓果汁澄清試驗

試驗主要采用果膠酶及作用時間的調(diào)試，發(fā)現(xiàn)0.64%果膠酶添加量，常溫過夜后于50 ℃下加熱90 min 可以得到較澄清的蔓越莓果汁。

野生蔓越莓果汁澄清試驗見表2。

表2 野生蔓越莓果汁澄清試驗

4.2 過氧化損傷模型的建立，D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影響

D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影響見表3。

由表3 可見，以D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 每日腹腔注射造模6 周后，模型組小鼠血清中MDA 含量明顯增加，與空白對照組比較差異有極顯著性（p＜0.01），說明過氧化損傷模型成立。

表3 D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA含量的影響（X±SD）

4.3 野生蔓越莓活悅飲對過氧化損傷模型小鼠MDA的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中MDA含量的影響見表4。

表4 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中MDA 含量的影響 （X±SD）

由表4 可見，與模型對照組比較，中、高劑量組小鼠血清和肝組織中MDA 的含量差異均有顯著性（p＜0.05 或p＜0.01）[16]。

4.4 野生蔓越莓活悅飲對GSH 的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中GSH含量的影響見表5。

表5 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中GSH 含量的影響 （X±SD）

野生蔓越莓活悅飲果汁樣品中原花青素含量為4.629 66 mg/mL。研究表明，原花青素人體推薦使用量為2.204 6 mg/kg·bw。人體標準體重為60 kg，每天喝132.276 mg/d，相當于28.57 mL。

由表5 可見，與模型對照組比較，高劑量組血清和中、高劑量組肝組織中還原型谷胱甘肽差異均有顯著性 （p＜0.05 或p＜0.01）。

4.5 野生蔓越莓活悅飲對蛋白質(zhì)羰基的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量的影響見表6。

由表6 可見，與模型對照組比較，各劑量組小鼠血清及肝組織蛋白質(zhì)羰基含量差異均無顯著性（p＞0.05）[17]。

表6 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量的影響（X±SD）

4.6 野生蔓越莓活悅飲對SOD 活力的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中SOD活力的影響見表7。

由表7 可見，與模型對照組比較，中、高劑量組血清和肝組織中SOD 活力差異均有顯著性（p＜0.05或p＜0.01）。

表7 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中SOD 活力的影響 （X±SD）

4.7 野生蔓越莓活悅飲對過氧化損傷模型小鼠體重的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠體重（g） 的影響見表8。

由表8 可見，給予受試物30 d，各劑量組小鼠的體重與模型對照組比較差異均無顯著性（p＞0.05）[18]。

表8 野生蔓越莓活悅飲對小鼠體重（g） 的影響（X±SD）

4.8 急性毒性研究中體重變化

在試驗中，試驗前和試驗結(jié)束時各受試動物體重均呈一定程度的增長，說明該供試品灌胃后未影響受試動物生長[19]。

對大鼠體重的影響見表9。

表9 對大鼠體重的影響（X±S，n=10）

4.9 急性毒性研究中毒性反應

在灌胃后直至試驗結(jié)束，大鼠一般狀態(tài)良好，毛順光亮，活動和飲食正常，糞便成型。無一動物死亡。

4.10 急性毒性研究中解剖所見

試驗結(jié)束次日，所有動物均進行了大體解剖觀察，肉眼未發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變，特別觀察了心、肝、脾、肺、腎、腦、胃腸等重要臟器。檢查結(jié)果未見出血、充血、滲出、潰瘍、穿孔、炎癥，胸腔、腹腔及心包腔均無積液。

4.11 急性毒性研究中大鼠最大灌胃量

（1） 大鼠最大灌胃量測定。結(jié)果表明，動物數(shù)20只，給藥質(zhì)量濃度46.3 mg/mL，每次給藥容積2 mL/100 g，給藥次數(shù)1 次/ d，給藥劑量6 g/kg，觀察時間14 d，無死亡。

（2） 微生物指標測定。根據(jù)GB 4789.2—2010 食品菌落總數(shù)標準測定野生野生蔓越莓活悅飲的細菌總數(shù)（CFU/g） ≤10 個/mL，并且未檢出致病菌。

（3） 野生蔓越莓活悅飲保質(zhì)期測定。于2017 年5 月份制備的野生野生蔓越莓活悅飲在自然條件下貯存12 個月，未發(fā)現(xiàn)沉淀物和其他任何異常現(xiàn)象。同時測定了菌落總數(shù)，結(jié)果仍為（CFU/g） ≤10 個/mL，可見蔓越莓具有很強的抑制細菌的性能。

5 結(jié)論

0.64 %果膠酶加入量，常溫過夜后于50 ℃下加熱90 min 可以得到較澄清的蔓越莓果汁。根據(jù)原花青素、紅花、枸杞、卡琪花蒂瑪?shù)娜胀扑]量配比制備了野生蔓越莓活悅飲。

經(jīng)口給予過氧化損傷模型小鼠66.138，22.046，11.023 g/kg·bw（相當于人推薦劑量的30 倍，10 倍，5 倍） 野生蔓越莓活悅飲30 d，可明顯降低血清及肝組織的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA） 含量，升高血清、肝組織抗氧化產(chǎn)物還原型谷胱甘肽（GSH） 含量及血清、肝組織的超氧化物歧化酶（SOD） 活力，與對照組比較差異有顯著性（p＜0.05）。根據(jù) “關于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9 個保健功能評價方法的通知” 中的判定標準，認為野生蔓越莓活悅飲具有抗氧化功能。

因受質(zhì)量濃度及灌胃容積的限制，無法測得大鼠的LD50。大鼠灌胃最大灌胃量為936 mg/kg，相當于人體使用劑量2.06 mg/kg 的450 倍。根據(jù)以上幾點，可以認為野生蔓越莓活悅飲毒性較小、安全。