HPLC法同時測定膜苞鳶尾中兩種有效成分

楊 陽 ，路 姣 ，趙長琦，高文運(yùn)

（1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安710021;2.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京100875；3.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國家微檢測系統(tǒng)工程研究中心，陜西 西安 710069）

鳶尾屬（Iris）是鳶尾科中最大的屬。目前，全世界鳶尾屬植物共計有300余種，我國約有60種，主要分布于西南、西北、東北及中部等地區(qū)。鳶尾屬植物在世界的許多國家和地區(qū)被用作傳統(tǒng)的藥用植物，具有抗炎，抗菌，抗病毒等作用[1]。鳶尾屬中最主要的化學(xué)成分為黃酮類，具有多樣并且良好的生物活性，被認(rèn)為是該屬藥材藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，可作為藥材的質(zhì)量評價指標(biāo)[2]。

膜苞鳶尾（Irisscariosa Willd.ex Link）為鳶尾科鳶尾屬植物，是新疆傳統(tǒng)中草藥鐮葉馬藺根的藥材基源，具有清熱解毒和利咽的藥效。課題組首次系統(tǒng)研究了膜苞鳶尾的化學(xué)成分及其抗炎活性[3，4]，野鳶尾苷、野鳶尾黃素等異黃酮類成分是膜苞鳶尾的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[5]，本實(shí)驗(yàn)建立了靈敏準(zhǔn)確的RPHPLC測定方法，同時對從膜苞鳶尾中分離得到的野鳶尾苷、野鳶尾黃素的含量進(jìn)行測定，可為膜苞鳶尾后續(xù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)，對該藥用植物的進(jìn)一步開發(fā)利用具有一定意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aglilent-1260系列高效液相色譜系統(tǒng)（包括四元梯度泵，50μL微量進(jìn)樣器，柱溫箱和DAD二極管陣列檢測器）；FA1004B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

野鳶尾苷、野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品為自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜（MS）、核磁（NMR）確認(rèn)，經(jīng) HPLC 測定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98%以上。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。乙腈為色譜純，H3PO4為分析純（天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）。

1.3 藥材

植物材料采自新疆察布查爾錫伯族自治縣，經(jīng)北京師范大學(xué)劉全儒教授鑒定為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Iris）膜苞鳶尾（Irisscariosa Willd.ex Link）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取野鳶尾苷3.0mg，野鳶尾黃素2.8mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至50mL。再精密移取10mL于25mL的容量瓶中，用甲醇定容，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，4℃冷藏待用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取膜苞鳶尾根莖干燥細(xì)粉（60目）1g，加甲醇100mL，索氏提取1h，濾過洗滌，合并濾液及洗滌液至250mL容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過后放置，4℃冷藏備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為VenusilASB C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.5%H3PO4水溶液，流速1.0mL·min-1，檢測波長269nm，柱溫 25℃，進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫條件見表1。膜苞鳶尾供試品和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液見圖1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Condition of gradient elution

圖1 供試品（A）和標(biāo)準(zhǔn)品（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sample（A）and reference substance（B）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品母液 1，2，3，4，5mL，置 10mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度混合對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，以峰面積積分值（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，野鳶尾苷得線性方程為Y=20.421X+2.03（r=0.9996），且質(zhì)量濃度在 2.4～12μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。野鳶尾黃素得線性方程為Y=39.165X+1.05（r=0.9995），且質(zhì)量濃度在 2.24～11.2μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.1.1項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品適量，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6次，記錄峰面積，計算出野鳶尾苷和野鳶尾黃素標(biāo)準(zhǔn)品峰面積積分值的RSD分別為0.33%，0.29%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批次膜苞鳶尾根莖粉末（60目），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算出野鳶尾苷和野鳶尾黃素分別為1.80mg·g-1，0.65mg·g-1，RSD 分別為 1.38%，1.80%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0、2、4、8、12、24h ，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果野鳶尾苷和野鳶尾黃素峰面積的RSD分為0.24%，0.33%，表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測定的膜苞鳶尾根莖粉末（60目）約1g，共6份，分別精密加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算野鳶尾苷和野鳶尾黃素的平均回收率分別為98.45%，97.93%，RSD值分別為2.29%，3.93%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of Recovery Test（n=6）

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取3個批次膜苞鳶尾根莖粉末（60目），按“2.1.2”項(xiàng)方法制備，分別進(jìn)樣 5μL，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法計算，化合物野鳶尾苷和野鳶尾黃素的含量見表3。

表3 膜苞鳶尾中野鳶尾苷和野鳶尾黃素的含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Experimental results on the content determination of iridin and irigenin in Iris scariosa

3 討論

膜苞鳶尾作為新疆中草藥鐮葉馬藺根的藥材基源，用于治療咽喉腫痛，音啞。但由于地理位置和經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的限制，此前未見到有關(guān)膜苞鳶尾化學(xué)成分的研究報道，本課題組首次報道了膜苞鳶尾的化學(xué)成分，其中的野鳶尾苷及野鳶尾黃素已被證實(shí)具有顯著的抗炎活性，是膜苞鳶尾清喉利咽的主要功效成分，本實(shí)驗(yàn)首次測定了膜苞鳶尾中的兩種黃酮類有效成分的含量，可為藥材的質(zhì)量評價提供方法學(xué)依據(jù)。

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動相的優(yōu)化 本試驗(yàn)分別考察了不同的流動相體系、流動相比例對主要成分分離情況的影響[6-9]。黃酮類結(jié)構(gòu)中常帶有酚羥基，為了抑制其解離，克服分離時的拖尾現(xiàn)象，流動相中需要加入酸調(diào)節(jié)pH值。本研究考察流動相以甲醇、乙腈作為有機(jī)相，0.1%H3PO4、0.5%H3PO4、1%HAc、0.5%HAc 作為水相。結(jié)果乙腈-0.5%H3PO4水溶液梯度洗脫時基線平穩(wěn)，各色譜峰峰型較好，分離效果最佳。

3.1.2 檢測波長的選擇 在 200～400nm進(jìn)行紫外光譜掃描，化合物野鳶尾苷和野鳶尾黃素均在269nm波長處有最大紫外吸收，故選擇269nm作為檢測波長。

3.2 樣品提取工藝的考察

以野鳶尾苷和野鳶尾黃素的提取率為指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯，甲醇，乙醇等3種提取溶劑對提取效率的影響，結(jié)果表明甲醇對野鳶尾苷和野鳶尾黃素的提取率均最高且峰形良好。同時考察了提取時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果為索式提取1h即可提取完全。

4 結(jié)論

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測定膜苞鳶尾中的野鳶尾苷和野鳶尾黃素的含量，實(shí)驗(yàn)方法簡單，儀器的精密度好，樣品的重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，回收率率符合分析測定的要求，結(jié)果可靠準(zhǔn)確?？梢杂糜谀ぐS尾中兩種黃酮類有效成分的含量測定，可為膜苞鳶尾的質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。