重組小鼠白細胞介素11致小鼠心肌纖維化的實驗探究*

陳雨露，汪新宇，鄭舒展，杜延飛△，葉 強，李家富，范忠才，李 光

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室，2西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室，四川瀘州646000）

纖維化是多種心血管疾病終末期的共同病理表現(xiàn)［1］，其發(fā)生在心臟時，會引起心肌結(jié)構(gòu)和電活動的紊亂［1-2］，最終導(dǎo)致心臟功能障礙和心力衰竭，成為心血管病患者致殘致死的主要原因［3］。心肌纖維化的本質(zhì)特征是心肌成纖維細胞大量增殖、活化以及分泌過多的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），包括Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖連蛋白等［4］。心肌纖維化的發(fā)生機制復(fù)雜且尚未完全闡明，目前臨床上仍缺乏有效的抗心肌纖維化藥物。因此，進一步闡明心肌纖維化的病理形成機制以及尋找新的纖維化干預(yù)靶點和治療藥物十分重要。

白細胞介素11（interleukin-11，IL-11）是IL-6 細胞因子超家族成員之一［5］，具有多種生理功能。最初，IL-11被發(fā)現(xiàn)能夠促進血小板生成［6］，后來隨著研究的深入被發(fā)現(xiàn)與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如上皮源的胃癌、腸癌和乳腺癌等以及造血系統(tǒng)的白血病和多發(fā)性骨髓瘤等［7-8］。近幾年，IL-11 又被發(fā)現(xiàn)一新的功能，即作為病理因子參與多種器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，且可能成為治療纖維化疾病的一個關(guān)鍵靶點［9-11］。但是，對于IL-11 功能的這一新的認(rèn)識，尤其是IL-11 與心肌纖維化關(guān)系，國內(nèi)還尚未見相關(guān)報道。另外，重組人IL-11 近年來常被用于臨床上惡性腫瘤患者化療后血小板減少癥的治療［12-13］，雖然顯示出不錯的療效，但IL-11這一新功能提醒我們它的使用有可能造成器官纖維化的嚴(yán)重毒副作用，因此我們呼吁大家有必要重新審視重組人IL-11 在臨床上的使用。故本文擬通過觀察皮下注射重組小鼠白細胞介素11（recombinant mouse IL-11，rmIL-11）對小鼠心臟結(jié)構(gòu)功能的影響以確定IL-11 的病理促纖維化作用，證實前人觀點同時為心肌纖維化研究提供一種全新的可靠的動物模型建立方法，還為國內(nèi)心肌纖維化的防治提供新的靶點、思路和理論依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級成年雄性 C57BL/6 小鼠 20 只，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 主要試劑

rmIL-11 購于上海優(yōu)寧維生物股份有限公司；RIPA（強）裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（P0018S）以及兔源抗GAPDH抗體購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑盒和Masson染色試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及fibronectin抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗購于上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。

3 主要方法

3.1 實驗分組 將20 只C57BL/6 小鼠隨機分為實驗（rmIL-11）組和對照（control）組，每組10 只。實驗組小鼠背部皮下注射 rmIL-11（100 μg·kg-1·d-1），連續(xù)注射3 周。對照組小鼠皮下注射等量的生理鹽水。

3.2 超聲心動圖檢測小鼠心功能 采用異氟烷氣體麻醉小鼠。小鼠呈仰臥位，將其四肢固定，脫毛膏除盡胸部毛，使用Vevo 3100 型小動物超聲儀，探頭置于胸部，測量評價左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricu?lar end-diastolic diamension，LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVEDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）等心功能指標(biāo)。

3.3 心重指數(shù)（cardiac weight index，CWI）的測定實驗結(jié)束后第2 天，2 組小鼠分別稱重，然后麻醉狀態(tài)下剪開胸部摘取心臟，稱重，計算CWI。CWI（mg/g）=全心重（mg）/體重（g）。

3.4 小鼠心臟HE 染色和Masson 染色 小鼠心臟標(biāo)本經(jīng)固定、石蠟包埋、切片一系列操作后，按照試劑盒說明書分別進行HE 和Masson 染色，觀察心臟組織病理變化及心肌纖維化的程度，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen vol?ume fraction，CVF）。CVF（%）=膠原的面積/總面積×100%。

3.5 Western blot 檢測ECM 蛋白的表達水平 取2組小鼠左室組織，用RIPA（強）裂解液提取總蛋白，然后BCA 法測定各組樣品蛋白濃度。取50μg 總蛋白進行SDS-PAGE，之后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜，然后放入兔抗 鼠 collagen I、collagen Ⅲ 及 fibronectin 抗 體（1∶1 000），4℃搖晃孵育過夜，洗膜，再用HRP 標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，洗膜。ECL 化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)后于Bio-Rad 成像系統(tǒng)曝光顯影，Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 超聲心動圖評價小鼠心功能

與對照組相比，rmIL-11 注射組小鼠的LVEF 和LVFS 明顯降低（P＜0.05），說明左室收縮功能下降；而LVEDd 和LVEDs 均明顯增大（P＜0.01），說明左室心腔擴大，見圖1。該結(jié)果表明rmIL-11 能使小鼠心功能明顯變差。

2 小鼠CWI的比較

與對照組相比，rmIL-11 注射組小鼠的CWI 明顯增大（P＜0.01），見圖2。

3 小鼠心室肌的HE和Masson染色觀察

HE染色和Masson染色結(jié)果分別如圖3和圖4所示，對照組的心肌細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，細胞間僅有少量的藍色膠原纖維；而rmIL-11組的心肌細胞排列紊亂，凋亡增多，且細胞間可見大量膠原纖維沉積。CVF計算結(jié)果顯示，rmIL-11組較對照組明顯升高（P＜0.01）。

4 rmIL-11 對小鼠心肌組織ECM 相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，rmIL-11 組小鼠心肌組織中的 collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及fibronectin 等ECM 組分蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），而這些蛋白的過量表達、沉積是導(dǎo)致纖維化發(fā)生的直接原因，見圖5。

Figure 2.Comparison of CWI between control and rmIL-11groups.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.圖2 兩組小鼠的CWI比較

Figure 3.The images of mouse myocardial tissues with HE staining（×100）.圖3 小鼠心肌組織的HE染色圖像

討 論

近年來，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，已成為威脅人類健康的頭號殺手。心肌纖維化是諸如心肌肥厚、心肌梗死以及心律失常等多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理生理過程，最終可導(dǎo)致心臟功能衰竭，是心血管疾病發(fā)病和死亡的重要原因。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)纖維化成為治療心血管疾病的一種重要策略，而尋找新的纖維化干預(yù)靶點和治療藥物是心肌纖維化防治的關(guān)鍵。

IL-11 是一種具有多種生物學(xué)功能的細胞因子。近年來，大家對其的關(guān)注點主要集中在IL-11 與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究上。同為IL-6 細胞因子超家族的成員，IL-6 的致纖維化作用目前已有不少文獻報道［14-16］，但IL-11 是否具有類似病理作用卻多年來一直未見報道。IL-11 的重要性被忽視和誤解如此長時間，主要原因之一是，一篇于2010 年發(fā)表在國際頂級醫(yī)學(xué)期刊《循環(huán)》的研究報道，重組人IL-11（rhIL-11）通過激活STAT3信號途徑明顯減輕小鼠心肌梗死后的心肌纖維化程度［17］，從而引導(dǎo)大家認(rèn)為IL-11 具有抗心肌纖維化作用，是一個心肌保護因子。此外，近年來另有不少研究都表明IL-11 是一個保護性的和抗炎癥的細胞因子［18-21］。直到2017 年底，IL-11 的真正面紗才被揭開，即 Schafer 等［9］發(fā)表于《自然》雜志的最新研究表明：IL-11及其受體特異高表達于活化后的心肌成纖維細胞中，且重組IL-11能誘導(dǎo)心肌成纖維細胞過度增殖、活化及ECM 蛋白合成；同時證明IL-11 是包括TGF-β1 在內(nèi)的眾多經(jīng)典促纖維化因子發(fā)揮促纖維化作用必須的下游信號控制點；靶向抑制IL-11 卻能明顯減輕模型小鼠的心肌纖維化程度。因此，該研究團隊提出，IL-11 是心血管纖維化的一個重要決定因子，同時是心血管纖維化的一個潛在治療靶點，這一發(fā)現(xiàn)得到了其他學(xué)者高度評價［22-23］。該團隊還稱將IL-11 作為治療靶點，有其優(yōu)越性，因為 IL-11 位于 TGF-β1 下游，抑制其表達可以避免類似抑制TGF-β1 的嚴(yán)重副作用。不僅如此，IL-11 的病理致纖維化作用同樣被該團隊在后續(xù)的腎臟［9］、肝臟［10］以及肺［11］纖維化研究中所證實，而該團隊同時也證明靶向抑制IL-11 信號后這些器官的纖維化狀況都明顯減輕，相關(guān)的研究成果分別發(fā)表在國際頂級期刊《自然》、《胃腸病學(xué)》和《科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》上。此外，Strikoudis 等［24］的最新研究也表明IL-11 在Hermansky-Pudlak 綜合征（HPS）患者的肺纖維化形成中起關(guān)鍵性作用，而對其敲除后發(fā)現(xiàn)在引入HPS4 突變的人肺類器官模型中纖維化發(fā)生明顯減輕，同樣證明了IL-11 的病理促纖維化作用和纖維化疾病潛在治療靶點這一觀點。在本實驗中，我們通過對小鼠皮下注射給藥rmIL-11，對IL-11的致心肌纖維化作用在體內(nèi)做進一步驗證，結(jié)果表明IL-11 確實能誘導(dǎo)小鼠心肌發(fā)生纖維化病變，證實IL-11是一個新型關(guān)鍵的促纖維化致病因子。

Figure 4.The images of myocardial collagen with Masson staining（×400）and the collagen volume fraction（CVF）in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.圖4 小鼠心肌膠原纖維的Masson染色圖像及膠原容積分?jǐn)?shù)

Figure 5.The protein levels of collagen Ⅰ，collagen Ⅲ and fibronectin in myocardial tissues were determined by Western blot.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 Western blot檢測2組小鼠心肌中Ⅰ型、Ⅲ型膠原及纖連蛋白的蛋白表達水平

目前動物心肌纖維化造模的方法有：腹主動脈部分結(jié)扎致心肌纖維化、冠狀動脈結(jié)扎致心肌纖維化、糖尿病心肌纖維化、自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化以及異丙腎上腺素致心肌纖維化等。其中最常用也最簡單的方法是皮下注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血損傷而導(dǎo)致纖維化。但小鼠注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌纖維化文獻較少，且各文獻對異丙腎上腺素的給藥劑量、時間間隔及總時長報道不一致，并且在造模過程中若注射劑量過大很容易導(dǎo)致小鼠直接死亡，而劑量過小往往不易形成纖維化模型［25］。本實驗中，我們通過對小鼠皮下注射rmIL-11，劑量為100μg/kg，每天1次，連續(xù)注射21 d，結(jié)果使小鼠心肌發(fā)生明顯纖維化病變。因此，本實驗可為心肌纖維化的研究提供一種新的可靠的動物模型建立方法。

值得注意的是，近年來rhIL-11 常被作為藥物用于臨床上一些重大疾病的輔助治療，如急性心肌梗死［26］、白血?。?2］以及實體腫瘤［13］等，雖然顯示出了一定的療效，但可以推測它的使用很有可能引發(fā)多器官纖維化的嚴(yán)重副作用。而且國內(nèi)確實存在關(guān)于注射用rhIL-11 引發(fā)患者心律失常、心衰等嚴(yán)重不良事件的文獻報道［27-28］。因此，我們呼吁大家有必要重新評估rhIL-11在臨床上的使用。

綜上所述，本研究表明rmIL-11 能誘導(dǎo)小鼠心肌發(fā)生纖維化病變，證實IL-11 是一個新型的關(guān)鍵促纖維化因子，同時也為心肌纖維化研究提供一種新的可靠的動物模型建立方法。再結(jié)合文獻報道，更重要的一點，IL-11 可能還是纖維化疾病的一個潛在治療靶點。