柴胡疏肝湯對自發(fā)性高血壓大鼠ROCK/JNK信號通路及動脈粥樣硬化的影響*

王鴻燕，黃正新，及 孟，趙月娥

（海南省中醫(yī)院心血管科，海南海口570203）

高血壓病是由多種病因相互作用引起的一種心血管綜合征，隨著社會發(fā)展，其發(fā)病率逐年增加，且越來越年輕化。研究報(bào)道，我國青少年高血壓的患病率約15%，15 歲及以上人群高血壓患病率高達(dá)24%，青少年罹患高血壓增加其成年期心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。高血壓病會導(dǎo)致全身循環(huán)動脈壓升高，對其靶器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，包括動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、動脈內(nèi)膜增厚、心室肥大等。目前，大量研究表明，高血壓引起體內(nèi)激烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)造成內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮損傷與AS 的發(fā)生密切相關(guān)［3-4］。AS 是由于脂質(zhì)超載巨噬細(xì)胞的積累導(dǎo)致動脈狹窄、泡沫細(xì)胞形成［5］。AS 不同階段依賴于氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙和炎癥，而高血壓或血脂異?？瑟?dú)立觸發(fā)AS 不同階段發(fā)生［6］。Rho 相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路與高血壓動脈功能相關(guān)［7］。柴胡疏肝湯（Chaihu-Shugan de?coction，CHSGD）有疏肝理氣的功能，在高血壓病舌象和代謝綜合征中發(fā)揮重要作用，推測CHSGD 對高血壓及AS 有一定治療作用［8］。本研究觀察CHSGD對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）ROCK/JNK信號通路及AS的影響，以期為CHSGD臨床治療高血壓病提供一定科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

8 周齡雄性 Wistar SHR 50 只，體質(zhì)量（250.12±5.04）g，同周 齡雄性 Wistar 大 鼠 10 只 ，體質(zhì) 量（249.36±4.35）g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2018-0013，動物使用許可證號為SYXK（京）2018-0027。動物單籠單只飼養(yǎng)，自由取食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)海南省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號：2018（倫審）0137］。

2 試劑及儀器

CHSGD 由柴胡 6 g、陳皮 6 g、芍藥 4.5 g、香附4.5 g、枳殼 4.5 g、川芎 4.5 g 和炙甘草 1.5 g 組成，加水 1 000 mL，浸泡 1 h，煎煮 30 min，煎 2 次，用 200 目濾網(wǎng)過濾去渣，將藥液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，生藥終濃度分別為0.25、0.5 和1 kg/L，消毒冷藏備用；復(fù)方羅布麻（compound kendir leaves，CKL；國藥準(zhǔn)字H14023052；片劑；批號20190713）購自山西津華暉星制藥有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（貨號50107ES50）購自上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號GL2091）購自北京百奧萊博科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號JT9344）購自北京吉美生物技術(shù)有限公司；抗RhoA抗體（貨號 ab187027）、抗 ROCK1 抗體（貨號ab45171）和抗 JNK 抗體（貨號 ab112501）購自 Ab?cam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗（貨號BHR101）購自北京博爾西科技有限公司；RIPA 組織裂解液（貨號SF1347）和BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（貨號P0010S）購自上海碧云天公司。

智能無創(chuàng)血壓計(jì)（型號BP-2010E）購自北京軟隆生物技術(shù)有限公司；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置（型號AU5800）購自北京市六一儀器廠；酶聯(lián)免疫分析儀（型號EVO75）購自Tecan；全自動生化分析儀（型號7020）購自Hitachi；正置光學(xué)顯微鏡（型號Eclipse Ci）購自Nikon；超低溫冰箱（型號MDF-U32V）購自Thermo。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 將50 只雄性Wistar SHR 隨機(jī)分為模型（model）組、CKL 組和 CHSGD 低、中、高劑量（CHSGD-L、CHSGD-M 和CHSGD-H）組，另選10只同源雄性Wistar 大鼠為正常對照（normal control，NC）組。CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H組大鼠分別用 2.5、5 和 10 g/kg 的 CHSGD 灌胃［9］（生藥終濃度分別為 0.25、0.5 和 1 kg/L，灌胃體積 10 mL/kg），分別是臨床劑量的 0.4、0.8 和 1.6 倍；CKL 組用 0.5 g/kg CKL 灌胃［10］，灌胃體積 10 mL/kg；model 組和NC組大鼠用等體積（10 mL/kg）生理鹽水灌胃。灌胃每日1次，連續(xù)4周。

3.2 各組大鼠生化指標(biāo)的檢測 治療前和治療4周后，在大鼠清醒平靜狀態(tài)下采用智能無創(chuàng)血壓計(jì)測量鼠尾動脈血壓。治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，從腹主動脈快速取血，離心取上清，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cho?lesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density li?poprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)NO、MDA和SOD的水平。

3.3 HE 染色觀察各組大鼠主動脈組織的病理變化 治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，取主動脈弓以下的主動脈，固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟、乙醇水洗、HE 染色、常規(guī)脫水，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

3.4 Western blot 檢測主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK 的蛋白表達(dá) 治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，取主動脈，使用組織裂解液提取主動脈組織總蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，加I抗（RhoA、ROCK1、JNK 和β-ac?tin 抗體，1∶2 000）4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜后加ECL 發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，并進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血脂水平的變化

治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與CKL 組相比，CHSGD-L和 CHSGD-M 組大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C 水平顯著升高（P＜0.05），而 CHSGD-H 組與 CKL 組大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

2 各組大鼠血壓的變化

治療前，與 NC 組相比，model、CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血壓顯著升高（P＜0.05）。治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血壓顯著升高（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血壓顯著降 低（P＜0.05）；與 CKL 組 相 比 ，CHSGD-L 和CHSGD-M 組 大 鼠 血 壓 顯 著 升 高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與CKL 組大鼠血壓的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。見表1。

3 各組大鼠主動脈組織的病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，NC 組大鼠內(nèi)膜光滑平整，管壁細(xì)胞分布整齊，各層結(jié)構(gòu)正常；model 組大鼠主動脈管徑增厚，內(nèi)皮下大量泡沫細(xì)胞形成，平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂；CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和CHS?GD-H 組大鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常，血管細(xì)胞排列較整齊，炎癥細(xì)胞浸潤較輕，見圖1。

4 各組大鼠血清中NO、MDA和SOD水平的變化

治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血清NO 和 SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 組大鼠血清NO 和SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低（P＜0.05）；與 CKL 組相比，CHSGD-L 和 CHSGD-M 組大鼠血 清 NO 和 SOD 水平顯 著 降 低 ，MDA 水平顯著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與 CKL 組大鼠血清 NO、SOD 和 MDA 水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表2。

5 各組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK蛋白表達(dá)的比較

治療4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CKL 組相比，CHSGD-L 和CHSGD-M 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與CKL 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖2及表2。

表1 各組大鼠血脂和治療前后血壓水平變化的比較Table 1.The changes of blood lipids after 4 weeks of treatment and the changes of blood pressure before and 4 weeks after treatment in the rats with different interventions（Mean±SD. n=10）

Figure 1.The images of the aorta with HE staining（×400）.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGD-H group.圖1 各組大鼠主動脈組織HE染色圖

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGDH group.圖2 Western blot檢測各組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白的表達(dá)

表2 各組大鼠血清中NO、MDA和SOD水平及主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表達(dá)的比較Table 2.The serum levels of NO，MDA and SOD，and the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments（Mean±SD. n=10）

討 論

高血壓和血脂異常是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，AS也是高血壓和心肌梗塞等心血管疾病的危險(xiǎn)因素［11-12］。研究表明，SHR 體內(nèi)血脂異常，血清內(nèi)皮素1（endo?thelin-1，ET-1）、TC、TG 和 LDL-C 水平顯著升高［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療4 周后，與NC 組相比，model 組大鼠血壓及血清中TG、TC 和LDL-C 水平顯著升高，提示SHR 存在高血壓和血脂異常癥狀。HE 染色可見model組大鼠主動脈管徑增厚，內(nèi)皮下大量泡沫細(xì)胞形成，平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，提示SHR 可能通過發(fā)生高血壓造成血脂異常，從而使主動脈發(fā)生病變，出現(xiàn)AS癥狀。

高血壓患者會出現(xiàn)頭痛、頭暈、尿液增多、胸悶、乏力等癥狀，臨床上常用利尿藥、鈣通道阻滯劑、血管張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等降壓藥，但長期服用對患者身體和經(jīng)濟(jì)造成較大的負(fù)擔(dān)。中草藥具有副作用小、成本低等特點(diǎn)，CHSGD 由柴胡、陳皮、芍藥、香附、枳殼、川芎和炙甘草七味中藥組成，為理氣劑，主要?dú)w心、肝、腎經(jīng)，具有疏肝理氣、活血止痛之功效［14-15］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，柴胡性微寒，味苦、辛，歸肝經(jīng)、膽經(jīng)，具透表泄熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，用于肝郁氣滯、脅肋脹滿疼痛及肝郁血虛，與高血壓患者頭痛、頭暈等癥狀吻合。研究表明，柴胡疏肝散可以降低高血壓患者TG、TC 和LDL-C 的水平，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降血壓作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療4 周后，與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 組大鼠血壓及血清中 TG、TC 和 LDLC 水平顯著降低，CHSGD-H 組大鼠血壓及血清中TG、TC和LDL-C水平與CKL組相比無顯著差異；HE染色可見 CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常，血管細(xì)胞排列較整齊，炎癥細(xì)胞浸潤較輕，提示CHSGD 可降低SHR 血壓，改善血脂情況，減輕主動脈損傷，緩解AS癥狀，且其濃度增加則作用增強(qiáng)。

高血壓病導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損害會造成血脂異?；颊叩难苁婵s功能喪失，血管收縮不均衡和血壓升高［16］。而高血壓患者中，血壓的進(jìn)一步升高會形成自我延續(xù)的惡性循環(huán)，加劇惡性高血壓病的發(fā)展和AS 病變進(jìn)程。SOD 是評價(jià)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的指標(biāo)；MDA 是自由基過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，是衡量脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)；NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放的，可以反映血管內(nèi)皮依賴性舒張功能［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與 NC 組相比，model 組大鼠 NO和SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高，提示高血壓病發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。柴胡疏肝散可以降低 MDA 和 SOD 表達(dá)，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 組大鼠血清 NO 和 SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低，提示CHSGD 可能通過下調(diào)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 及上調(diào)NO 和SOD 表達(dá)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低血壓，從而改善血管舒張功能。

ROCK1是RhoA 下游靶基因，與細(xì)胞增殖、遷移等功能相關(guān)。最近大量研究表明，RhoA/ROCK 通路在高血壓、AS、糖尿病等疾病中發(fā)揮重要作用［19］。JNK 又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated pro?tein kinase，SAPK），屬于MAPK 家族，在胞外基質(zhì)的代謝和AS 形成中發(fā)揮重要作用。研究表明，抑制ROCK/JNK信號通路，可以減少血管平滑肌細(xì)胞過度遷移，減輕血管內(nèi)膜增厚，與AS、心肌梗塞、中風(fēng)等心血管疾病密切相關(guān)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療4 周后，與NC 組相比，model 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達(dá)顯著升高，提示RhoA、ROCK1和JNK可能參與自發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與model 組相比，CKL、CHS?GD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白 表達(dá)顯 著降 低 ，提 示CHSGD可能通過抑制ROCK/JNK 信號通路相關(guān)因子RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達(dá)，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕AS癥狀。

綜上所述，CHSGD 可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕AS 癥狀，可能是通過下調(diào)ROCK/JNK 信號通路相關(guān)蛋白RhoA、ROCK1 和JNK 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。