粉防己堿通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬*

申屠樂，陳夢靜，李影影，李 菲

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310005）

卵巢癌是婦科最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，且具有低齡化發(fā)展的趨勢。由于卵巢癌缺乏早期癥狀和早期診斷的檢測手段，當(dāng)卵巢癌被確診時(shí)，通常已是晚期［1］。因此，如何盡早預(yù)防和尋找有效治療手段一直是卵巢癌研究的重點(diǎn)。

粉防己堿（tetrandrine）是一種雙芐基異喹啉類生物堿，是從防己科植物粉防己的塊根中提取的主要有效成分。粉防己堿作為傳統(tǒng)中藥已被廣泛應(yīng)用于臨床，有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗纖維化等廣泛的藥理作用［2］。近年來研究顯示，粉防己堿能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，作為一潛在的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用受到研究者的重視［3］。自噬在腫瘤細(xì)胞中具有雙重作用，一方面，它能起到細(xì)胞的保護(hù)作用；另一方面，它也能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。但目前越來越多的研究表明抑制自噬可增強(qiáng)腫瘤治療的效果［4］。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，粉防己堿可通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤作用［5］；粉防己堿通過自噬依賴的Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌轉(zhuǎn)移［6］。然而，粉防己堿抑制卵巢癌細(xì)胞增殖是否與誘導(dǎo)自噬有關(guān)，目前鮮見報(bào)道。

因此，本研究通過體外觀察粉防己堿對人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細(xì)胞自噬的影響，以期為粉防己堿抗卵巢癌作用深入研究和臨床應(yīng)用提供一定的參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細(xì)胞購自ATCC。

1.2 主要試劑 粉防己堿購自成都曼思特生物科技有限公司；MTT 購于碧云天生物有限公司；吖啶橙和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自 Sig?ma-Aldrich；胎牛血清購自Gibco；胰蛋白酶和RPMI-1640 培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、P62、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、AKT、p-AKT 和 GAPDH 抗體購自 Cell Signaling Tech?nology；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天生物有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，以每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后細(xì)胞完全貼壁，加入0、2、4、8和16μmol/L的粉防己堿，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 濃度為2 g/L的MTT，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，將孔板中液體吸出，每孔加入DMSO 150 μL，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測定各孔波長490 nm 的吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞相對活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 吖啶橙染色 將SKOV3細(xì)胞以5×107/L的密度接種于24孔板，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜，24 h 后細(xì)胞完全貼壁，加入不同濃度的粉防己堿作用于SKOV3 細(xì)胞，將24孔板放培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去24孔板中的含藥培養(yǎng)液，PBS 輕輕清洗3 遍，用終濃度為1 mg/L 的吖啶橙溶液避光染色15 min，再用PBS 輕輕清洗染色后的SKOV3細(xì)胞，PBS 清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白的水平 收集不同濃度的粉防己堿處理后的SKOV3 細(xì)胞，棄去含藥培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 洗滌，再用RIPA 細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測定各作用組蛋白濃度進(jìn)行定量。按4∶1 加入loading buf?fer，將定量后的蛋白樣品在100℃下煮5 min 使蛋白變性；取等量的蛋白樣品（15μg）加入到配制好的丙烯酰胺凝膠泳道中電泳分離，然后將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用含5%牛血清白蛋白將膜封閉1 h，TBST清洗后，分別加入對應(yīng)I抗（抗mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、LC3 和 P62 抗體均按 1∶1 000 稀釋，抗GAPDH 抗體按1∶2 000 稀釋），4℃孵育過夜；第2 天用TBST洗膜3次，每次5 min，再加入對應(yīng)II抗（按1∶3 000 稀釋），室溫?fù)u床孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次5 min；將ECL發(fā)光液滴于PVDF 膜上，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光采圖，并用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 粉防己堿抑制SKOV3細(xì)胞活力

采用MTT 法檢測粉防己堿（0、2、4、8 和16 μmol/L）對SKOV3 細(xì)胞活力的影響，與對照（0 μmol/L）組相比，粉防己堿顯著抑制SKOV3 細(xì)胞的活力，且呈一定的劑量依賴性，作用24 h 其半數(shù)抑制濃度為15.21μmol/L，見圖1。

2 粉防己堿增加SKOV3細(xì)胞自噬溶酶體的產(chǎn)生

由于酸性的差異，吖啶橙染色使細(xì)胞中的自噬溶酶體顯示橘紅色熒光，而細(xì)胞核則顯示綠色熒光。吖啶橙染色結(jié)果顯示，采用粉防己堿干預(yù)SKOV3 細(xì)胞后，顯示橘紅色熒光的細(xì)胞增多，且細(xì)胞中橘紅色熒光的區(qū)域增大，其中以4和8μmol/L粉防己堿的作用較為明顯，說明粉防己堿增加了SKOV3 細(xì)胞中酸性自噬溶酶體的數(shù)量，見圖2。

Figure 1.The effect of different concentrations of tetrandrine for 24 h on the viability of SKOV3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖1 不同濃度粉防己堿作用24 h對SKOV3細(xì)胞活力的影響

3 粉防己堿誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬

Western blot 結(jié)果顯示，粉防己堿干預(yù)SKOV3 細(xì)胞24 h 后，自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)，P62 蛋白水平也顯著升高（P＜0.01），提示粉防己堿能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞自噬，見圖3。

Figure 2.Tetrandrine induced autophagosome accumulation in the SKOV3 cells（acridine orange staining，×400）.圖2 不同濃度粉防己堿對SKOV3細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體形成的影響

4 抑制自噬增強(qiáng)粉防己堿對SKOV3細(xì)胞活力的抑制作用

為明確粉防己堿誘導(dǎo)的自噬與SKOV3 細(xì)胞活力的關(guān)系，將自噬抑制劑3-MA 與粉防己堿聯(lián)合作用SKOV3 細(xì)胞。粉防己堿（4 和8 μmol/L）與3-MA（5 mmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合處理SKOV3 細(xì)胞 24 h 后，MTT結(jié)果顯示，與單獨(dú)粉防己堿處理組相比，粉防己堿聯(lián)合3-MA 處理組SKOV3 細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.01），說明 3-MA 增強(qiáng)了粉防己堿對 SKOV3 細(xì)胞活力的抑制作用，見圖4。

5 粉防己堿抑制SKOV3 細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路

Western blot 結(jié)果顯示，用粉防己堿干預(yù)SKOV3細(xì)胞24 h 后，與對照（0 μmol/L）組相比，粉防己堿能明顯降低p-mTOR 和p-AKT 蛋白的水平（P＜0.01），然而粉防己堿對mTOR 和AKT 總蛋白的水平無明顯影響，見圖5。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱand P62 in the SKOV3 cells treated with tetrandrine.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖3 粉防己堿對SKOV3細(xì)胞LC3和P62蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA） en?hanced the inhibitory effect of tetrandrine（TET）on the viability of SKOV3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L TET group；##P＜0.01 vs 4 μmol/L TET group；△△P＜0.01 vs 8 μmol/L TET group.圖4 自噬抑制劑增強(qiáng)粉防己堿對SKOV3 細(xì)胞活力的抑制作用

討 論

卵巢癌是目前全球危害女性健康常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，并且年輕化趨勢越來越明顯。粉防己堿是從中藥粉防己的塊根中提取到的一種雙芐基喹啉生物堿，已被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床治療高血壓和心律失常等［7］?，F(xiàn)在越來越多的研究顯示粉防己堿可通過誘導(dǎo)自噬在治療腫瘤方面有潛在的療效。Guo 等［8］報(bào)道粉防己堿通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞自噬，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Huang 等［9］研究顯示粉防己堿誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡。然而粉防己堿誘導(dǎo)自噬對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，目前研究尚少。

我們通過吖啶橙染色及Western blot 法檢測自噬相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)粉防己堿可誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞發(fā)生自噬。自噬是在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過程，其功能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽略的作用。大量研究表明，自噬在腫瘤細(xì)胞中具有雙重作用，一方面，它能起到保護(hù)細(xì)胞的作用；另一方面，它也能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡［10］。但最近越來越多的研究表明抑制自噬可增強(qiáng)腫瘤治療的效果。為了明確粉防己堿誘導(dǎo)的自噬是保護(hù)細(xì)胞的作用還是導(dǎo)致自噬性的細(xì)胞死亡，本研究使用了粉防己堿與自噬抑制劑3-MA 聯(lián)合用藥，觀察SKOV3細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示，與單獨(dú)加入粉防己堿相比，同時(shí)加入自噬抑制劑3-MA 和粉防己堿更能顯著抑制SKOV3 細(xì)胞活力。這說明抑制細(xì)胞自噬并不能逆轉(zhuǎn)粉防己堿對SKOV3 細(xì)胞的殺傷作用，反而增強(qiáng)了對細(xì)胞的抑制作用。

Figure 5.The protein levels of p-mTOR，mTOR，p-AKT and AKT in the SKOV3 cells treated with tetrandrine.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖5 粉防己堿對SKOV3細(xì)胞p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT蛋白水平的影響

自噬受多條信號通路調(diào)控，PI3K/AKT/mTOR 信號通路是調(diào)節(jié)自噬的重要信號通路之一。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，PI3K 被激活，然后通過使AKT 磷酸化，進(jìn)而激活下游的mTOR 等信號分子，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，其核心蛋白mTOR 是決定自噬體形成和成熟的關(guān)鍵蛋白［11-12］。抑制 mTOR 的功能，使 PI3K/AKT/mTOR 通路失活，則可以誘導(dǎo)自噬［13-14］。為了進(jìn)一步明確粉防己堿誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制，我們采用Western blot 檢測了PI3K/AKT/mTOR 信號通路中的關(guān)鍵蛋白mTOR、p-mTOR、AKT和p-AKT 水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，粉防己堿能顯著降低SKOV3 細(xì)胞中p-mTOR 和p-AKT的蛋白水平，而mTOR 和AKT 總蛋白水平變化不大，說明粉防己堿抑制了SKOV3 細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化。

綜上所述，粉防己堿可通過誘導(dǎo)人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其分子機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活化有關(guān)。本研究為粉防己堿應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。