煙酸經(jīng)LXRα/NPC1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇外流*

楊 萍，張漢斌，劉鈺林，方淑香，李 平，許小洋△

（廣州醫(yī)科大學(xué) 1第二臨床學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州511436）

在動(dòng)脈粥樣斑塊的形成過程中，巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇攝取、代謝及排出這一穩(wěn)態(tài)機(jī)制的破壞是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-3］?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，在動(dòng)脈粥樣斑塊的泡沫細(xì)胞中，過量膽固醇蓄積在溶酶體中［4-5］，提示巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇的調(diào)節(jié)異常是導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成、進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

溶酶體瞬時(shí)感受器電位黏脂蛋白1（transient re?ceptor potential mucolipin 1，TRPML1）鈣通道或尼曼-皮克C1 蛋白（Niemann-Pick C1 protein，NPC1）膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷，可造成以溶酶體脂質(zhì)蓄積為特征的溶酶體貯積癥［6-7］，與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理特征非常相似。已有報(bào)道顯示，煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate，NAADP）可促進(jìn) Ca2+經(jīng) TRPML1 通道釋放［8］，提示NAADP 有可能通過抑制溶酶體膽固醇蓄積，進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞的形成，但其詳細(xì)的信號(hào)機(jī)制目前尚不甚明了，已有少數(shù)報(bào)道提示肝X 受體α（liver X re?ceptor α，LXRα）可能在此機(jī)制中起一定作用［9-10］。

鑒于NAADP 及NPC1 在溶酶體中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用，本研究從NAADP 合成底物——煙酸（nicotinic acid，NA）入手，觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇外流的影響，并對(duì)此過程中LXRα 和NPC1 所起的作用進(jìn)行了探討，以期為闡明巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)支持。

材料和方法

1 材料

人單核-巨噬細(xì)胞株THP-1 購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購 自 Gibco；LXRα小 干 擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、NPC1siRNA 及大鼠抗人β-actin 和溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）抗體購自Santa Cruz；siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒購自SignaGen；煙酸購自Sigma；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Qiagen；Alexa Fluor 633標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（H+L）購自Thermo Fisher；細(xì)胞培養(yǎng)玻片（8 室）購自Biologix；氧化型低密度脂蛋白（oxi?dized low-density lipoprotein，oxLDL）購自廣州瑞千公司；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購自Promega；filipin complex（filipin）、NAADP 拮 抗 劑trans-Ned-19（Ned-19）和 Ca2+螯合劑 BAPTA 購自Cayman；Nile red購自MCE；抗NPC1兔多抗購自Mil?lipore；BeyoECL Plus（超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒）和DMSO 購自碧云天；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自SouthernBiotech。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所用細(xì)胞系為人單核-巨噬細(xì)胞株THP-1，經(jīng)PMA 誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后使用［11］：以1×109/L 的密度將THP-1 細(xì)胞置于裝有10 mL RPMI-1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和2%雙抗）的T25 培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以每孔6×105個(gè)接種于6 孔板中，加入PMA（終濃度100μg/L）誘導(dǎo)分化48 h備用。

2.2 Ned-19 及BAPTA 處理 在NA 影響溶酶體膽固醇外流的實(shí)驗(yàn)中，先加入Ned-19 或BAPTA，1 h 后加入NA，再過1 h 后加入oxLDL，48 h 后固定細(xì)胞，經(jīng)破膜、LAMP1抗體標(biāo)記、filipin和Nile red染色等處理以進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。在NA 影響NPC1蛋白及LXRα mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，按上述時(shí)間依次加入Ned-19（或BAPTA）、NA 和oxLDL，24 h 后提取總 RNA 用于檢測(cè) LXRα 的 mRNA 表達(dá)，48 h 后提取蛋白用于檢測(cè)NPC1的蛋白表達(dá)。

2.3 激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞游離膽固醇及脂質(zhì)蓄積 巨噬細(xì)胞游離膽固醇和中性脂質(zhì)分別通過filipin 和Nile red 熒光染色劑染色；溶酶體采用溶酶體膜表面特征蛋白LAMP1 抗體免疫標(biāo)記。將誘導(dǎo)分化好的巨噬細(xì)胞按每室5×104個(gè)接種于8室細(xì)胞培養(yǎng)玻片中，經(jīng)不同處理后，按已報(bào)道的方法進(jìn)行固定、破膜、LAMP1 抗體標(biāo)記、filipin 染色［9，12］，之后細(xì)胞用Nile red 孵育10 min，PBS洗1次后封片，用于激光共聚焦檢測(cè)。激光共聚焦掃描拍照采用LSM 510多光子激光掃描顯微鏡（Carl Zeiss），不同通道圖像采取依次掃描方式獲取以防止干擾，整個(gè)過程所有參數(shù)均保持一致。Alexa Fluor 633、filipin 和Nile red熒光成像的激發(fā)/發(fā)射波長（λEx/λEm）分別為633 nm/650～710 nm、740 nm/435～485 nm 和 514 nm/535～590 nm。熒光強(qiáng)度采用Image-Pro 9.1軟件（Media Cyber?netics）定量，其中filipin 熒光強(qiáng)度代表游離膽固醇的量，Nile red 熒光強(qiáng)度代表中性脂質(zhì)的量。同時(shí)分析filipin 與 LAMP1 之間的共定位系數(shù)（Pearson 相關(guān)系數(shù)），以判定溶酶體中游離膽固醇的量。

2.4 Western blot 檢測(cè)NPC1 蛋白的表達(dá) 因NPC1蛋白分子量較大，故在進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)時(shí)注意個(gè)別特殊條件，其余均參照已有報(bào)道中的方法［13］，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的Western blot 程序完成。特殊條件為蛋白提取之后不過夜即電泳，隨即以電壓30 V于4℃環(huán)境轉(zhuǎn)膜16 h；常溫用抗NPC1抗體（濃度1∶500）孵育4 h。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè) LXRα 的 mRNA 表達(dá) 提取總RNA 后，按已有報(bào)道中的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，檢測(cè) LXRα 的 mRNA 表達(dá)［12］。LXRα 的上游引物序列為5'-CAAGATGCAGGAGACCAGGG-3'，下游引物序列為5'-GCTGACTCCAACCCTATCCC-3'。

2.6LXRα及NPC1的 RNA 干擾實(shí)驗(yàn) 采用 Gen?Mute轉(zhuǎn)染試劑盒，依照原報(bào)道中的方法［12］將LXRα及NPC1siRNA 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。RNA 干擾效應(yīng)于轉(zhuǎn)染24 h 后經(jīng) RT-qPCR 驗(yàn)證。在LXRαsiRNA 影響 NPC1蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，于轉(zhuǎn)染scrambled siRNA 和LXRαsiRNA 后 24 h 加入 NA 和 oxLDL，48 h 后提取蛋白進(jìn)行 Western blot。在LXRα及NPC1siRNA 影響NA 促溶酶體膽固醇外流效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，于轉(zhuǎn)染siRNA 后 24 h 加入 NA 和 oxLDL，再經(jīng) 48 h 后固定細(xì)胞，再經(jīng)破膜、LAMP1 抗體標(biāo)記、filipin 和 Nile red 染色等處理以進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 12.5 for Windows 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 oxLDL 濃度依賴性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的oxLDL 處理后，激光共聚焦結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞游離膽固醇（藍(lán)色，filipin 染色）的蓄積逐漸增加，Image-Pro 圖片分析結(jié)果顯示藍(lán)色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見圖1A、B。采用LAMP1 標(biāo)記溶酶體（紅色），可見oxLDL 處理后疊加圖片中的紫色（藍(lán)+紅→紫）部分增強(qiáng)，經(jīng)Image-Pro 分析共定位系數(shù)表明，溶酶體內(nèi)膽固醇的蓄積明顯增加（P＜0.05），見圖1A、C。隨著oxLDL 濃度的增加，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴（黃色）也明顯增多（圖1A、D）。

2 NA抑制巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積

若在巨噬細(xì)胞接受oxLDL 處理前加入不同濃度的NA，則可發(fā)現(xiàn)，隨著NA 濃度的增加，巨噬細(xì)胞中游離膽固醇的蓄積明顯減少（P＜0.05），見圖2A、B；共定位系數(shù)分析結(jié)果也顯示，溶酶體中游離膽固醇的蓄積逐漸降低，在NA 濃度為1～10 mmol/L 時(shí)效果顯著（P＜0.05），見圖2A、C。但NA 對(duì)巨噬細(xì)胞中脂滴的蓄積無明顯影響（圖2A）。

3 Ned-19 和BAPTA 抑制NA 減少溶酶體游離膽固醇蓄積的效應(yīng)

在上一實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，加入NAADP 拮抗劑Ned-19或細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA，則NA 減少溶酶體游離膽固醇蓄積的效應(yīng)被顯著抑制（圖3A～C），提示NA 的效應(yīng)可能是通過NAADP 促進(jìn)溶酶體TRPML1通道釋放Ca2+所介導(dǎo)。但Ned-19及BAPTA對(duì)脂滴同樣沒有明顯影響（圖3A、D）。

4 NA促進(jìn)NPC1表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，NA 可顯著促進(jìn) NPC1 蛋白的表達(dá)，而Ned-19 和BAPTA 則可顯著抑制NA 促NPC1 表達(dá)的效應(yīng)（P＜0.05），見圖4。這提示NA 促溶酶體游離膽固醇外流的機(jī)制與其促進(jìn)NPC1 蛋白表達(dá)有關(guān)。

5 NA促進(jìn)LXRα的mRNA表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，NA 可顯著提高 LXRα 的mRNA 表達(dá)，但這種效應(yīng)可被 Ned-19 和 BAPTA 明顯抑制（P＜0.05），見圖5。這種效應(yīng)與NA 促進(jìn)NPC1蛋白表達(dá)的效應(yīng)基本一致，提示LXRα 與NPC1 之間可能有一定的聯(lián)系。

6 LXRα介導(dǎo)NA對(duì)NPC1表達(dá)的上調(diào)

為確定NA 促進(jìn)NPC1 表達(dá)是否是經(jīng)核受體LXRα 介導(dǎo)，我們利用LXRαsiRNA 敲減LXRα的表達(dá)，再觀察NA對(duì)NPC1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，LXRαsiRNA 可明顯干擾LXRα mRNA 表達(dá)（圖6A）；LXRα被siRNA 干擾后，NA 促NPC1蛋白表達(dá)的效應(yīng)被顯著抑制（P＜0.05），見圖6B、C，提示LXRα 介導(dǎo)了NA對(duì)NPC1表達(dá)的上調(diào)。

7 敲減LXRα 和NPC1 表達(dá)明顯減弱NA 促溶酶體膽固醇外流的效應(yīng)

為進(jìn)一步確認(rèn)NA 促溶酶體膽固醇外流效應(yīng)的機(jī)制，我們利用siRNA 分別敲減LXRα和NPC1表達(dá)，觀察其對(duì)NA 減少巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，敲減LXRα和NPC1表達(dá)后，NA減少巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積的效應(yīng)被明顯抑制（P＜0.05），見圖7。這進(jìn)一步提示LXRα 和NPC1 在NA促進(jìn)溶酶體膽固醇外流的效應(yīng)中起重要作用。

討 論

Figure 1.oxLDL dose-dependently increased lysosomal free cholesterol（FC）accumulation in macrophages.Macrophages were incu?bated with oxLDL at different concentrations（20～80 mg/L）for 48 h and labelled with filipin（FC，blue），LAMP1 antibody（lysosomes，red）and Nile red（lipid droplets of cholesteryl ester，yellow）.Purple spots in the merged images represented the FC sequestered in lysosomes.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluores?cence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1；D：fluorescence intensi?ty of Nile red staining for lipid droplets（cholesteryl ester）.lm：lumen，the SI unit of luminous flux.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 oxLDL濃度依賴性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體中膽固醇的蓄積

巨噬細(xì)胞可通過清道夫受體A 吞噬oxLDL 并將其移至溶酶體中，在溶酶體酸性脂肪酶的作用下，ox?LDL 中的膽固醇酯被水解成游離膽固醇和脂肪酸［1，14］。游離膽固醇可經(jīng)溶酶體NPC1蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中［1］，其中大部分被運(yùn)送至細(xì)胞膜成為細(xì)胞膜的組成部分［15］；另一部分被運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)酰基輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT-1）催化，與脂肪酸結(jié)合酯化成膽固醇酯而儲(chǔ)存在胞質(zhì)中；還有一部分則可通過ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1/G1（ATP-binding cassette transporter A1/G1，ABCA1/ABCG1）經(jīng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外［16-19］。若膽固醇和膽固醇酯在巨噬細(xì)胞內(nèi)蓄積則可使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，這種現(xiàn)象是動(dòng)脈粥樣斑塊產(chǎn)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)［2，20］。

NA 是抗動(dòng)脈粥樣硬化的常用藥物，其藥理機(jī)制主要與其抗血脂作用有關(guān)［21］。近來發(fā)現(xiàn)其除了抗血脂作用外，還有其他不依賴脂質(zhì)的抗粥樣硬化效應(yīng)，如降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中起招募單核細(xì)胞作用的黏附分子的表達(dá)、通過激活單核巨噬細(xì)胞的NA 受體——羥基羧酸受體2（hydroxycarboxylic acid receptor 2，HCA2）而抑制單核巨噬細(xì)胞向動(dòng)脈斑塊的聚集、促進(jìn)ABCA1 和ABCG1 的表達(dá)以增加巨噬細(xì)胞中游離膽固醇向高密度脂蛋白的轉(zhuǎn)移等［21-24］，提示NA 的抗粥樣硬化機(jī)制廣泛。

Figure 2.NA dose-dependently inhibited the accumulation of lysosomal free cholesterol（FC）in the macrophages incubated with ox?LDL（40 mg/L）.A：confocal fluorescence images；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1（lysosome）.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs oxLDL group；#P＜0.05 vs control group.圖2 NA濃度依賴性地抑制巨噬細(xì)胞溶酶體中膽固醇的蓄積

本研究發(fā)現(xiàn)，NA 呈濃度依賴性地降低巨噬細(xì)胞中溶酶體游離膽固醇的蓄積（即促進(jìn)溶酶體游離膽固醇的外流），外流出溶酶體的游離膽固醇可經(jīng)RCT途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，從而產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。NA 的這種效應(yīng)可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的另外一條重要途徑。雖然對(duì)其促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體游離膽固醇外流的機(jī)制尚不清楚，但有必要對(duì)其進(jìn)行深入探討。

溶酶體膜上存在非特異性TRPML1 Ca2+通道［11］和 NPC1 膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體［25］。經(jīng)溶酶體 TRPML1 通道的Ca2+釋放與溶酶體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切［26］。TRPML1突變（引起溶酶體Ca2+釋放減少）或NPC1缺陷將導(dǎo)致兩類溶酶體貯積癥［6-7，27］，分別為 IV 型黏脂貯積癥（mucolipidosis type IV）［28］和 C1 型尼曼-皮克病（Niemann-Pick disease type C1）［29］，二者均與動(dòng)脈粥樣斑塊的病理特征非常相似，其本質(zhì)均為溶酶體脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂。

已有報(bào)道表明，NAADP 可促進(jìn)Ca2+經(jīng)TRPML1通道釋放［8］，提示其可能參與溶酶體膽固醇的調(diào)節(jié)。本研究中NA 作為NAADP 生成的底物（由ADP 核糖基環(huán)化酶CD38催化NADP+與NA 反應(yīng)產(chǎn)生），其減少巨噬細(xì)胞中游離膽固醇蓄積的效應(yīng)可能與NAADP促TRPML1釋放Ca2+的作用密切相關(guān)，而后者也可能通過某種途徑參與了NPC1功能的調(diào)節(jié)，影響巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇代謝。

為此，本研究觀察了NAADP 拮抗劑Ned-19 及Ca2+螯合劑BAPTA 對(duì)NA 促溶酶體游離膽固醇外流效應(yīng)的影響。結(jié)果表明二者均可顯著抑制NA 的上述效應(yīng)，提示NA 的效應(yīng)可能是通過增加NAADP 合成，進(jìn)而促進(jìn)溶酶體TRPML1 通道釋放Ca2+所導(dǎo)致。這與我們?cè)瓉淼膱?bào)道相一致，即NAADP 合成酶CD38基因敲除的小鼠，經(jīng)高脂飲食后冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的粥樣斑塊，且該部位巨噬細(xì)胞溶酶體中膽固醇的蓄積明顯升高［12］。

如前所述，溶酶體膜上的NPC1膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體與其膽固醇調(diào)節(jié)密切相關(guān)，NA 促進(jìn)TRPML1 釋放的Ca2+可能通過某種機(jī)制影響NPC1的表達(dá)而促進(jìn)溶酶體中游離膽固醇的外流。因此，我們進(jìn)一步觀察了NA、NAADP 拮抗劑 Ned-19 及 Ca2+螯合劑 BAPTA 對(duì)NPC1蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)NA可顯著促進(jìn)NPC1蛋白表達(dá)，此效應(yīng)可被Ned-19 和BAPTA 所抑制，提示NA 的效應(yīng)與其通過NAADP 促進(jìn)TRPML1 通道釋放Ca2+，進(jìn)而上調(diào)NPC1蛋白表達(dá)有關(guān)。

Figure 3.NAADP antagonist Ned-19 and calcium chelator BAPTA attenuated the effect of NA on lysosomal free cholesterol（FC）ac?cumulation.Macrophages were incubated with oxLDL at 40 mg/L in the presence of NA（5 mmol/L）combined with Ned-19（100 μmol/L）or BAPTA（5 μmol/L）for 48 h and labelled with filipin（FC，blue），LAMP1 antibody（lysosomes，red）and Nile red（lipid droplets of cholesteryl ester，yellow）.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1；D：fluorescence intensity of Nile red staining for lipid droplets（cholesteryl ester）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NA+oxLDL group.圖3 NAADP拮抗劑Ned-19和鈣離子螯合劑BAPTA抑制NA對(duì)溶酶體膽固醇蓄積的效應(yīng)

而經(jīng)TRPML1 通道釋放的Ca2+通過何種途徑促進(jìn)NPC1蛋白表達(dá)，目前尚不清楚。曾有報(bào)道顯示核受體 LXRα 是 NPC1 表達(dá)上調(diào)的重要信號(hào)因子［30］。為此，本研究繼續(xù)觀察了NA、Ned-19 及BAPTA 對(duì)LXRα mRNA 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，NA 可顯著提高 LXRα 的 mRNA 表達(dá)，這一效應(yīng)亦可被 Ned-19 和BAPTA顯著抑制；而當(dāng)敲減LXRα基因表達(dá)后，NA促NPC1 蛋白表達(dá)的效應(yīng)被顯著抑制。這部分結(jié)果與已有的報(bào)道和我們近期發(fā)表的結(jié)果相一致［9-10，30］，提示NA促NPC1表達(dá)的效應(yīng)由LXRα介導(dǎo)。

為進(jìn)一步確認(rèn)LXRα 和NPC1 在巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇外流中的作用，本研究利用RNA 干擾技術(shù)分別敲減LXRα和NPC1的表達(dá)，結(jié)果顯示 NA 減少巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積的效應(yīng)被明顯抑制。這進(jìn)一步證實(shí)LXRα 和NPC1 在NA 促進(jìn)溶酶體膽固醇外流的效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

Figure 4.NA promoted NPC1 protein expression in oxLDL-loaded macrophages.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 NA促進(jìn)oxLDL處理的巨噬細(xì)胞中NPC1蛋白的表達(dá)

Figure 5.NA promoted mRNA expression of LXRα in oxLDL-loaded macrophages.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖5 NA 促進(jìn)oxLDL 處理的巨噬細(xì)胞中LXRα mRNA 的表達(dá)

由于本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是基于人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，雖然相對(duì)于動(dòng)物原代培養(yǎng)細(xì)胞而言更接近于人類本身，但所有研究工作均是在細(xì)胞水平開展的，因此，今后如能結(jié)合人類的臨床標(biāo)本或臨床數(shù)據(jù)，則可取得更具影響力的數(shù)據(jù)。此外，本研究結(jié)果顯示，NA 對(duì)巨噬細(xì)胞中的脂滴無明顯影響，其中機(jī)制還有待闡明。

Figure 6 The effect of NA on NPC1 protein expression was abolished by LXRα siRNA in oxLDL-loaded macro?phages.The macrophages were transfected with 20μmol/L scrambled siRNA or LXRα siRNA，and 24 h after transfection，they were incubated with 40 mg/L of oxLDL in the presence of 5 mmol/L NA for 48 h.A：the mRNA expression of LXRα 24 h after transfec?tion was detected by RT-qPCR to evaluate the inter?ference efficiency of LXRα siRNA；B：the protein level of NPC1 after NA+oxLDL treatment for 48 h was determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs scrambled siRNA.圖6 LXRα siRNA消除NA對(duì)NPC1表達(dá)的作用

綜上所述，NA 可顯著促進(jìn)溶酶體膽固醇外流，這可能是NA 抗動(dòng)脈粥樣硬化的另外一條重要途徑，其機(jī)制可能是：NA 增加NAADP 的生成，進(jìn)而促進(jìn)TRPML1 通道 Ca2+的釋放，后者以核受體 LXRα 為介導(dǎo)，上調(diào)NPC1 蛋白表達(dá)，最終促進(jìn)溶酶體膽固醇外流。至于Ca2+以LXRα 為介導(dǎo)上調(diào)NPC1 蛋白表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制，仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

Figure 7.The effect of NA on lysosomal free cholesterol（FC）accumulation was abolished by LXRα siRNA（siLXRα）and NPC1 siRNA（siNPC1）in oxLDL-loaded macrophages.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1.Scr：Scram?bled siRNA.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NA+oxLDL group or Scr+NA+oxLDL group.圖7 LXRα siRNA和NPC1 siRNA抑制NA促溶酶體游離膽固醇外流的效應(yīng)