腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)性miR-99a對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長和侵襲的調(diào)控作用

文 靜，黃 潔，李云云，張中卒，周 勤

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016；

2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院（陸軍特色醫(yī)學(xué)中心）內(nèi)科，重慶 400042；

3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 402160；

4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科，重慶 402160

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是婦科常見惡性腫瘤之一，占女性所有癌癥相關(guān)死亡的2.1%［1］。EC整體預(yù)后良好，但是對于晚期及特殊病理學(xué)類型患者預(yù)后仍較差。因此了解其具體的發(fā)病機(jī)制對EC的治療具有重要意義。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是腫瘤微環(huán)境中重要的細(xì)胞亞群，參與腫瘤增殖和侵襲調(diào)控［2］。根據(jù)細(xì)胞功能、活化狀態(tài)，巨噬細(xì)胞分為兩種類型：M1型和M2型［3］。M1型由經(jīng)典活化途徑獲得，主要存在于炎性反應(yīng)環(huán)境中，分泌IL-12和IL-23等促炎因子，參與炎性反應(yīng)；而M2型由替代活化途徑獲得，主要存在于腫瘤微環(huán)境中，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程調(diào)控，因此被許多研究報(bào)道稱為TAM［4］。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞浸潤與多種腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，其中包括EC［5］，但其作用機(jī)制尚不十分明確，本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測TAM在EC細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人EC細(xì)胞系HEC-1B、RL95-2和人單核細(xì)胞系U937購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；新生胎牛血清購自美國PAA公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和RIPA裂解液購自美國Invitrogen公司；青霉素和鏈霉素購自美國Sigma公司；miR-99a mimic、對照序列（scramble mimic）和DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo公司；TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Life Technologies公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所。巨噬唾液酸蛋白（macrosialin）CD68及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1）CD31購自武漢Boster公司，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Bcl-2、E-cadherin及N-cadherin購自美國CST公司，蛋白提取試劑盒及GAPDH購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)

HEC-1B和RL95-2均用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。U937懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的6孔板中（1×106個/mL）。培養(yǎng)24 h后加入EC細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)30 h，可見細(xì)胞貼壁生長。更換新鮮EC細(xì)胞培養(yǎng)上清液繼續(xù)培養(yǎng)18 h。檢測誘導(dǎo)前后U937細(xì)胞中CD68、CD163及CD206的表達(dá)水平，驗(yàn)證TAM誘導(dǎo)成功與否。

1.3 組織標(biāo)本收集

本實(shí)驗(yàn)收集2014年8月—2016年8月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)病理科醫(yī)師確診為EC患者的EC組織標(biāo)本75例。年齡33～81歲［平均年齡（65.6±0.78）歲］。術(shù)前均未行放化療。術(shù)后經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)病理科診斷分期，Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ～Ⅳ期26例，病理分化類型，G1～G2型36例，G3型39例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者53例，肌層浸潤深度≥1/2肌層者50例，肌層浸潤深度＜1/2肌層者25例。44例EC組織中CD68呈高表達(dá)，高表達(dá)率為58.7%；31例陰性/低表達(dá)，陰性/低表達(dá)率為41.3%。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

將病理組織學(xué)切片置于56 ℃下烘烤2 h后，再逐級脫蠟和水化；隨后行抗原修復(fù)；然后血清封閉30 min；一抗4 ℃過夜；第2天二抗室溫30 min；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺顯色，在顯微鏡下觀察切片，被染黃后終止顯色，最后脫水、透明、中性樹膠封片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，對細(xì)胞染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分比共同評定量化。

1.5 miRNA測序

收集8對不同浸潤深度的EC組織，分選出腫瘤間質(zhì)中CD68+TAM，對其進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的差異分析。在北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行miRNA測序，根據(jù)測序結(jié)果篩選出浸潤深度＞1/2肌層與浸潤深度＜1/2肌層的EC患者癌灶組織中TAM中差異表達(dá)的miRNA，并對有明顯差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析。

1.6 TAM轉(zhuǎn)染及與EC細(xì)胞共培養(yǎng)

將EC細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)后的TAM分兩組，按DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑說明書介紹的方法，將miR-99a mimic或scramble mimic分別轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)后的TAM中。轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染miR-99a或scramble的TAM分別接種于transwell小室上室內(nèi)，與下室中EC細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)36 h。共培養(yǎng)結(jié)束后，收集下室內(nèi)的EC細(xì)胞，做進(jìn)一步的功能檢測。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測

收集6孔板內(nèi)的細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，再用PBS將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至試管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液，98 μL PBS重懸細(xì)胞后，避光加入2 μL流式細(xì)胞術(shù)用抗體CD206、CD163及CD68（德國Miltenyi公司），4 ℃溫育30 min，洗去抗體后，上BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測。采用CFlow軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

采用TRIzol法分別提取誘導(dǎo)前后及轉(zhuǎn)染前后單核細(xì)胞中總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄；實(shí)驗(yàn)操作按TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，分別檢測M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68、CD163、CD206的表達(dá)水平和miR-99a表達(dá)水平。引物序列CD68上游為5’-CTACTTGCCATCCTTCA-3’，下游為5’-G TGGTTTTGTGGCTCTTGGTA-3’；CD163上游為5’-TTTTGTCACCAGTTCTCTTGGA-3’，下游為5’-AGCCATTATTACACACGTTCC-3’；CD206上游為5’-GGATGGAAGCAAAGT GGATTAG-3’，下游為5’-CTACTGTTATGT CGCTGGCAAA-3’；基因內(nèi)參GAPDH上游：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游：5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’。miR-99a上游：5’-GCGAACCCGTAGATCCG AT-3’，下游：5’-CAGTGCAGGGTCCGAG GT-3’；miRNA內(nèi)參U6上游：5’-CTCGCTTCG GCAG CACATATACT-3’，下游：5’-ACGCTT CACGAATTTGCGTGTC-3’。RTFQ-PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括：SYBR Green Mix 10 μL、引物（4 μmol/L）各1 μL、cDNA模板1 μg和ddH2O 7 μL。RTFQ-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共39個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測單核細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子

收集TAM轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液，分別檢測巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子IL-12、IL-4和IL-10的含量，具體試驗(yàn)步驟分別按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。利用全波長光吸收酶標(biāo)儀檢測450和570 nm波長處各反應(yīng)孔的吸光度（D）值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各孔對應(yīng)的質(zhì)量濃度值。

1.10 CCK-8檢測EC細(xì)胞的增殖活性

共培養(yǎng)36 h后，將各組EC細(xì)胞分別均勻接種于96孔板中（8×103個細(xì)胞/孔），每組均設(shè)3個復(fù)孔。分別于0、24、48和72 h在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中溫育2 h，然后用自動酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在450 nm波長處的D值（參比波長為650 nm），以此反映細(xì)胞增殖活性。

1.11 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測EC細(xì)胞的侵襲能力

將基質(zhì)膠于冰上稀釋，取40 μL平鋪于transwell小室（8 μm孔徑），37 ℃溫育，待膠凝固。將共培養(yǎng)的EC細(xì)胞，取4×105個細(xì)胞于小室上室內(nèi)用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；小室下層加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行趨化。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，吸掉上室內(nèi)培養(yǎng)液，用棉簽擦去上層未穿膜細(xì)胞，PBS洗3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色8 min，PBS洗3次。風(fēng)干后用刀片揭膜并用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下拍照。隨機(jī)計(jì)數(shù)6個視野（×100）中結(jié)晶紫染色的細(xì)胞數(shù)，以此反映各組細(xì)胞的侵襲能力。

1.12 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

依據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，蛋白濃度用二喹啉甲酸法測定，10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗，4 ℃溫育過夜。次日二抗37 ℃溫育1 h，然后洗膜、顯影。GAPDH為內(nèi)參。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 7.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對兩組間差異進(jìn)行比較，細(xì)胞生長曲線分析采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAM浸潤與EC的肌層浸潤及血管新生相關(guān)

收集75例EC及對應(yīng)癌旁組織，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法分析其中CD68+TAM浸潤細(xì)胞數(shù)，并分析其與EC的病理學(xué)特征之間的相關(guān)性（圖1）。CD68高表達(dá)與患者的年齡、病理學(xué)分期及病理學(xué)分化類型無明顯相關(guān)性，與患者的肌層浸潤深度呈正相關(guān)，提示TAM浸潤與EC的浸潤相關(guān)。

圖1 浸潤深度≥1/2肌層與浸潤深度＜1/2肌層的EC患者腫瘤組織中CD68+ TAM細(xì)胞及CD31+細(xì)胞免疫組織化學(xué)示例圖Fig.1 Representative pictures of immunohistochemistry staining of CD68+ and CD31+ cells in endometrial cancer (EC) tissues with different myometrial invasion depth

同時我們運(yùn)用CD31檢測腫瘤組織內(nèi)微血管密度，結(jié)果證實(shí)，CD68高表達(dá)與CD31高表達(dá)呈正相關(guān)（表1），提示EC的浸潤及腫瘤新生血管形成與TAM細(xì)胞的浸潤密切相關(guān)。

2.2 miR-99a參與EC組織TAM的浸潤調(diào)控

本研究采用免疫磁珠法分選出腫瘤間質(zhì)中CD68+TAM，并運(yùn)用miRNA基因微陣列技術(shù)比較浸潤深度＞1/2肌層與浸潤深度＜1/2肌層的8對EC患者癌灶組織中TAM miRNA表達(dá)譜的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸潤深度＞1/2肌層患者組織TAM中miR-99a的表達(dá)較浸潤深度＜1/2肌層患者組織TAM中表達(dá)明顯下降（圖2）；我們的前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，相比癌旁對照組織，EC腫瘤組織中miR-99a的表達(dá)明顯下降，且miR-99a能夠抑制EC的生長以及浸潤調(diào)控［6］，提示miR-99a的抑癌功能可能不僅作用于腫瘤細(xì)胞本身，同時作用于腫瘤微環(huán)境中的TAM。

表1 CD68表達(dá)水平高低與EC病理學(xué)特征的相關(guān)性分析Tab.1 The analysis of relation between CD68 expression level and clinicopathological parameters of EC

圖2 基因芯片篩查不同肌層浸潤深度的腫瘤組織間質(zhì)中CD68+細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜的差異Fig.2 Differences of miRNA expression profiles in CD68+ cells with different depth of myometrial invasion

2.3 誘導(dǎo)人單核細(xì)胞向TAM細(xì)胞極化及鑒定

已有研究證實(shí)，腫瘤組織微環(huán)境可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞募集并極化，EC細(xì)胞也被證實(shí)在體外能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞向具有M2型表型巨噬細(xì)胞極化［7］。收集EC細(xì)胞（HEC-1B及RL95-2）條件培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基與懸浮人單核細(xì)胞U937共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈貼壁生長，收集貼壁后細(xì)胞。運(yùn)用RTFQ-PCR檢測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68、CD163及CD206表達(dá)情況，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后單核U937細(xì)胞呈貼壁生長，貼壁后U937細(xì)胞中CD68（t=7.349，P＜0.01）、CD163（t=12.90，P＜0.01）及CD206（t=11.83，P＜0.01）表達(dá)均明顯升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)差異變化，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測其中CD68、CD163及D206表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后單核細(xì)胞中CD68、CD163及D206均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示單核細(xì)胞U937向M2型巨噬細(xì)胞分化（圖3）。

圖3 人單核細(xì)胞的極化及鑒定Fig.3 Polarization of human monocytes and identification

2.4 過表達(dá)miR-99a能夠逆轉(zhuǎn)單核細(xì)胞向TAM極化

將人工合成的miR-99a mimic（實(shí)驗(yàn)組）及scramble（對照組）分別轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞中（HEC-1B-U937及RL95-2-U937）。RTFQ-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-99a后誘導(dǎo)后細(xì)胞miR-99a表達(dá)水平較scramble組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.61，P＜0.01；t=13.81，P＜0.01；圖4A）。轉(zhuǎn)染miR-99a后單核細(xì)胞組CD68及CD163均較對照組表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.179，P＜0.01；t=11.78，P＜0.01；圖4B），CD206表達(dá)下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.9951，P＞0.05，圖4B），進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)上述表達(dá)變化（圖4C），提示過表達(dá)miR-99a能夠逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。而進(jìn)一步運(yùn)用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染miR-99a后單核細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)差異，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-99a后HEC-1B/RL95-2-U937細(xì)胞中IL-12較對照組分泌量增加，而IL-4、IL-10較對照組分泌量減少（t=6.236、4.896、5.857，P＜0.01，圖4D），結(jié)果進(jìn)一步表明過表達(dá)miR-99a能夠逆轉(zhuǎn)單核巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化。

2.5 miR-99a逆轉(zhuǎn)TAM對EC細(xì)胞增殖促進(jìn)作用

既往研究證實(shí)，誘導(dǎo)后TAM與EC細(xì)胞共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)EC細(xì)胞增殖及侵襲，促進(jìn)腫瘤發(fā)生［8］。為了探索miR-99a在TAM介導(dǎo)對EC細(xì)胞增殖作用的影響，將miR-99a轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)后單核細(xì)胞中（miR-99a-HEC-1B/RL95-2-U937），將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于transwell小室的上室內(nèi)，與下室EC細(xì)胞（HEC-1B/RL95-2）共培養(yǎng)36 h，CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-99a誘導(dǎo)后單核細(xì)胞組的EC細(xì)胞（HEC-1B/RL95-2-U937）增殖能力較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HEC-1B-U937：miR-99avsscramble，48 h：t=4.841，P＜0.01；72 h：t=4.975，P＜0.01；RL95-2-U937：miR-99avsscramble，48 h：t=4.980，P＜0.01；72 h：t=4.742，P＜0.01，圖5），結(jié)果表明，miR-99a能夠抑制TAM對EC細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

圖4 miR-99a抑制誘導(dǎo)后單核細(xì)胞的極化Fig.4 miR-99a inhibits polarization of induced monocyte

圖5 CCK-8法檢測過表達(dá)miR-99a的TAM共培養(yǎng)后HEC-1B及RL95-2細(xì)胞增殖能力變化Fig.5 The effects of co-culture with TAM transfected with miR-99a on the proliferation of HEC-1B and RL95-2 cells were detected by CCK-8 assay

2.6 miR-99a抑制TAM共培養(yǎng)對EC細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用

將與轉(zhuǎn)染后TAM共培養(yǎng)36 h的EC細(xì)胞重新鋪于transwell小室（8.0 μm孔徑）上室內(nèi)，檢測TAM轉(zhuǎn)染miR-99a前后對EC細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-99a的TAM組HEC-1B及RL95-2的穿膜能力較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.148，P＜0.05；t=4.376，P＜0.05；圖6），提示miR-99a能夠抑制TAM細(xì)胞對EC細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。

圖6 過表達(dá)miR-99a的TAM共培養(yǎng)后EC細(xì)胞侵襲能力的變化Fig.6 The invasive capacities of HEC-1B and RL95-2 cells co-cultured with TAM transfected with miR-99a were detected by transwell chamber invasion assay

2.7 mTOR可能參與TAM相關(guān)miR-99a在EC中的作用

為了進(jìn)一步探究miR-99a可能參與TAM調(diào)控的機(jī)制，運(yùn)用兩種不同的miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站（miRanda和TargetScan）對miR-99a可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測并且進(jìn)行交叉對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mTOR是miR-99a的靶基因之一。而mTOR在巨噬細(xì)胞調(diào)控中的作用也引起了科學(xué)家們廣泛的興趣。因此，我們初步檢測了mTOR及其下游蛋白在轉(zhuǎn)染miR-99a后單核細(xì)胞中表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-99a能夠下調(diào)誘導(dǎo)后單核細(xì)胞中mTOR及其下游蛋白的表達(dá)，提示其可能參與miR-99a相關(guān)作用調(diào)控。此外，我們進(jìn)一步檢測了其誘導(dǎo)后細(xì)胞中凋亡基因Bcl-2表達(dá)及EMT相關(guān)E-cadherin及N-cadherin蛋白水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)基因Bcl-2及N-cadherin表達(dá)下降，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，提示過表達(dá)miR-99a能夠下調(diào)誘導(dǎo)后單核細(xì)胞抑制其凋亡蛋白表達(dá)，并可能抑制細(xì)胞的EMT過程參與其調(diào)控作用（圖7）。

圖7 過表達(dá)miR-99a的TAM中mTOR及其下游蛋白水平變化Fig.7 The expression of mTOR in TAM transfected with miR-99a

3 討 論

腫瘤相關(guān)微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中TAM是微環(huán)境中主要的炎癥細(xì)胞群。根據(jù)細(xì)胞功能、活化狀態(tài)的差異，巨噬細(xì)胞可被誘導(dǎo)為兩種類型，即經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型巨噬細(xì)胞分泌IL-12、IL-23等促炎因子、趨化因子和效應(yīng)分子［7］，而M2型巨噬細(xì)胞可分泌IL-4、IL-10等大量抗炎因子，表達(dá)表征分子如CD68、CD163、CD206等［8］。其中M2型存在于腫瘤微環(huán)境中，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，因此被許多研究報(bào)道稱為TAM。本研究中通過檢測EC間質(zhì)中CD68陽性巨噬細(xì)胞浸潤情況，評估其與EC病理學(xué)特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞浸潤與EC的肌層浸潤及血管新生密切相關(guān)，但與腫瘤患者的年齡、分期及分化無明顯相關(guān)性。進(jìn)一步比較不同浸潤深度腫瘤組織中巨噬細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miR-99a在浸潤深度較深的EC巨噬細(xì)胞中低表達(dá)，提示其可能發(fā)揮作用。TAM可以促進(jìn)新生血管生成、破壞結(jié)締組織、清除細(xì)胞碎片和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤的形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用［2］，而腫瘤細(xì)胞向周圍環(huán)境分泌的細(xì)胞因子變化也能誘導(dǎo)單核細(xì)胞向M2表型分化［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的U937細(xì)胞中CD68、CD163及CD206表達(dá)水平升高，提示單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，而這一作用可以被過表達(dá)miR-99a所抑制，提示miR-99a可能參與巨噬細(xì)胞調(diào)控。

miR-99a已被證實(shí)在宮頸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌和頭頸部鱗癌等多種腫瘤中低表達(dá)，恢復(fù)miR-99a的表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。我們的前期實(shí)驗(yàn)證明miR-99a能抑制EC的惡性行為［6］，但是這種抑制作用是否引起微環(huán)境改變，是否涉及對巨噬細(xì)胞極化的影響尚不清楚。因此，我們將miR-99a轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)成功的TAM，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后M2表型CD68及CD163較對照組表達(dá)下降，且促炎因子IL-12分泌增多，而抗炎因子IL-4、IL-10分泌減少，表明巨噬細(xì)胞向M1型極化，提示miR-99a可以抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化。

為了進(jìn)一步探究miR-99a可能參與TAM調(diào)控的機(jī)制，我們運(yùn)用兩種不同的miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站（miRanda和TargetScan）對miR-99a可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測并且進(jìn)行交叉對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mTOR是miR-99a的靶基因之一。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通路抑制劑—雷帕霉素可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-12、IL-23等促炎癥因子，下調(diào)IL-10的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞向M1型極化；而mTOR通路的激活可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-10，抑制促炎因子的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞向M2型極化［11］。因此，我們推測mTOR可能參與了miR-99a對TAM介導(dǎo)的對EC惡性生物學(xué)表型的影響。結(jié)果證實(shí)，誘導(dǎo)后單核細(xì)胞中過表達(dá)miR-99a能夠明顯抑制mTOR及其下游基因的表達(dá)，提示mTOR通路可能參與其作用調(diào)節(jié)。此外，我們進(jìn)一步檢測了其誘導(dǎo)后細(xì)胞中凋亡基因Bcl-2表達(dá)及EMT相關(guān)E-cadherin及N-cadherin蛋白水平的變化，結(jié)果提示過表達(dá)miR-99a能夠下調(diào)誘導(dǎo)后單核細(xì)胞抑制其凋亡蛋白表達(dá)，并可能抑制細(xì)胞的EMT過程。

綜上所述，miR-99a可能通過靶向調(diào)節(jié)mTOR通路參與EC中TAM極化及其介導(dǎo)EC生長及侵襲的調(diào)控。