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    組織工程產(chǎn)品用種子細(xì)胞的質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化

    2020-09-07 12:25:18韓倩倩趙君王苗苗曲明悅王春仁李靜莉
    組織工程與重建外科雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:供體細(xì)胞系病原體

    韓倩倩 趙君 王苗苗 曲明悅 王春仁 李靜莉

    【提要】 組織工程產(chǎn)品主要是利用生物學(xué)和工程學(xué)的原理來構(gòu)建受損組織的功能性替代品,以恢復(fù)、維持或改善組織功能。含細(xì)胞成分的組織工程產(chǎn)品在體外構(gòu)建時(shí)離不開載體支架材料與種子細(xì)胞的相互調(diào)控和配合。種子細(xì)胞作為原材料之一,參與體外培養(yǎng)構(gòu)建產(chǎn)品,同時(shí)也轉(zhuǎn)化為組織工程產(chǎn)品的組成成分來發(fā)揮作用。組織工程產(chǎn)品構(gòu)建用種子細(xì)胞不同于細(xì)胞治療用干細(xì)胞,其作為構(gòu)建組織工程產(chǎn)品的原材料,在構(gòu)建過程中細(xì)胞本身會(huì)發(fā)生生物學(xué)變化,最終與支架材料形成一個(gè)有機(jī)的整體。組織工程產(chǎn)品用種子細(xì)胞因其獨(dú)特性,要用專門的視角理順其質(zhì)量控制指標(biāo),以保證組織工程產(chǎn)品的質(zhì)量。

    器官或組織的損傷或功能缺損是人類健康中最常見、最具破壞性且代價(jià)最高的問題之一。組織工程產(chǎn)品是應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理來開發(fā)恢復(fù)、維持或替代組織器官的產(chǎn)品,成為組織器官缺損治療的希望。組織工程產(chǎn)品在體外構(gòu)建時(shí),離不開載體支架與種子細(xì)胞的相互調(diào)控和配合。組織工程用細(xì)胞作為原材料之一,參與體外培養(yǎng)構(gòu)建產(chǎn)品,同時(shí)也轉(zhuǎn)化為組織工程產(chǎn)品的組成成分來發(fā)揮作用。其中,如何獲得可以提供所需功能的種子細(xì)胞或細(xì)胞替代品是利用組織工程學(xué)構(gòu)建和創(chuàng)造新組織的重要環(huán)節(jié)[1]。本文參照ISO 18362Manufactureofcell-basedhealthcareproducts[2]、《GB/T 36988-2018組織工程用人源組織操作規(guī)范指南》[3]、《中國(guó)藥典》[4]、《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》[5]等指導(dǎo)文件,對(duì)組織工程產(chǎn)品用種子細(xì)胞的質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行綜述,分別對(duì)細(xì)胞供體的樣本準(zhǔn)入要求、細(xì)胞的采集及加工要求、關(guān)鍵生產(chǎn)物料的質(zhì)控要求、細(xì)胞庫(kù)建設(shè)的指導(dǎo)要求及與支架材料共培養(yǎng)結(jié)束后的放行檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)進(jìn)行總結(jié)。

    1 細(xì)胞供體的準(zhǔn)入要求

    根據(jù)《中國(guó)藥典》(2015版)三部 《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中規(guī)定,細(xì)胞系/株應(yīng)具有細(xì)胞系/株來源的相關(guān)資料:①細(xì)胞系/株制備機(jī)構(gòu)的名稱,細(xì)胞系/株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料,這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得,也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn);②人源細(xì)胞系/株須具有細(xì)胞系/株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別及生理狀況的相關(guān)資料;③動(dòng)物來源的細(xì)胞系/株須具有動(dòng)物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、病原體檢測(cè)結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資料;④如采用已建株的細(xì)胞系/株,應(yīng)從具有一定資質(zhì)的細(xì)胞保藏中心獲取細(xì)胞,且應(yīng)提供該細(xì)胞在保藏中心的詳細(xì)傳代過程,包括培養(yǎng)過程中所使用的原材料的相關(guān)信息,具有細(xì)胞來源的證明資料。

    1.1 供體篩查的基本要求

    根據(jù)GB/T 36988-2018《組織工程用人源組織操作規(guī)范指南》,通過供體篩查和供體檢測(cè)結(jié)果確定供體資質(zhì)是否合格,負(fù)責(zé)簽署分發(fā)的負(fù)責(zé)人應(yīng)判定并記錄細(xì)胞或組織供體的合格性。只有符合下列條件的供體才能成為合格的供體。①無(wú)可傳播性病原體或疾病感染的臨床證據(jù);②無(wú)因異種移植而產(chǎn)生傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn);③可傳播性病原體檢測(cè)結(jié)果為陰性或無(wú)反應(yīng)性。除供體資質(zhì)確定豁免特例之外,所有供體均應(yīng)進(jìn)行篩查,主要是通過審核供體的醫(yī)療記錄來分析可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。

    1.2 供體檢測(cè)的基本要求

    供體檢測(cè)總的要求是盡可能地降低傳染性疾病的危險(xiǎn)性,檢測(cè)試驗(yàn)室應(yīng)對(duì)供體樣本的傳播性病原體進(jìn)行檢測(cè)。如果供體年齡小于1個(gè)月,則應(yīng)檢測(cè)其母親樣本。應(yīng)在獲取供體細(xì)胞或組織時(shí)對(duì)供體樣本進(jìn)行檢測(cè),如果在獲取細(xì)胞或組織時(shí)不能取樣進(jìn)行檢測(cè),則應(yīng)在獲取前或獲取后7 d內(nèi)采集樣本進(jìn)行檢測(cè)。如果供者僅提供外周血干細(xì)胞/祖細(xì)胞,在獲取細(xì)胞前采集樣本檢測(cè)的時(shí)間最多不得超過30 d。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門簽發(fā)批準(zhǔn)的、明確用于血源篩查的試劑,并且應(yīng)按照試劑生產(chǎn)企業(yè)的說明書進(jìn)行操作。一旦國(guó)家批準(zhǔn)了新的病原體的篩查試劑或針對(duì)尸體檢測(cè)的試劑,則檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用這些新批準(zhǔn)的試劑。檢測(cè)試驗(yàn)室應(yīng)具有相應(yīng)的檢測(cè)資質(zhì)。

    為盡可能地降低傳染性疾病的危險(xiǎn)性,應(yīng)對(duì)所有的細(xì)胞或組織供體的樣本進(jìn)行下列可傳播性病原體的檢測(cè):人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)、人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-Ⅱ)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋體。

    為降低可傳播性病原體的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)于活的含白細(xì)胞的細(xì)胞或組織供體樣本,還應(yīng)檢測(cè)與細(xì)胞相關(guān)的可傳播性病原體,包括人T-淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)、人T-淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅱ型(HTLV-Ⅱ)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)。

    對(duì)于硬腦膜供體,應(yīng)對(duì)可傳播性海綿狀腦炎病毒進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。

    由于人類對(duì)病原體的認(rèn)識(shí)在不斷更新,而且新的病原體不斷出現(xiàn),一旦有充分的數(shù)據(jù)證明某種病原體可通過人源細(xì)胞/組織傳播并嚴(yán)重危害人類健康,則應(yīng)増加這種新型可傳播性病原體的檢測(cè),病毒的檢測(cè)應(yīng)采用最為敏感的檢測(cè)方法。

    2 細(xì)胞的采集及加工要求

    生產(chǎn)單位或機(jī)構(gòu)應(yīng)建立細(xì)胞或組織的采集程序,包括設(shè)施、環(huán)境控制、設(shè)備、物料和試劑、標(biāo)簽管理、貯存、人源細(xì)胞/組織的接收、發(fā)運(yùn)前運(yùn)輸與發(fā)運(yùn)。細(xì)胞或組織的采集單位應(yīng)使用不會(huì)產(chǎn)生污染或交叉污染的方法采集細(xì)胞或組織。評(píng)估所有與采集相關(guān)的操作,包括技術(shù)程序、人員、設(shè)備、物料和試劑以及采集樣本運(yùn)送程序等,以確定這些操作活動(dòng)能夠控制污染和交叉污染。細(xì)胞或組織采集應(yīng)采用無(wú)菌技術(shù),不應(yīng)從有感染的身體部位采集。

    細(xì)胞或組織采集前應(yīng)確認(rèn)并記錄供體身份。對(duì)非活體供體,宜通過核對(duì)授權(quán)文件和/或醫(yī)療記錄的身份證號(hào)碼、年齡、性別、種族及體質(zhì)量等信息確認(rèn),并對(duì)文件或記錄照相保存。對(duì)活體供體,宜通過問詢供者姓名、身份證號(hào)碼等確認(rèn)供者,并詳細(xì)記錄身份核對(duì)的方法及結(jié)果,問詢時(shí)間及問詢者姓名等。

    采集過程應(yīng)有詳細(xì)的記錄,人源細(xì)胞/組織的生產(chǎn)單位或機(jī)構(gòu)應(yīng)定期審計(jì)采集單位的記錄并確認(rèn)供體身份,以確保供體記錄與人源細(xì)胞/組織確為同一供體。同時(shí)在活體供體采集過程中,應(yīng)對(duì)造成或可能造成活體供體傷害的任何不良事件以及原因的調(diào)查結(jié)果記錄進(jìn)行審查。

    生產(chǎn)單位或機(jī)構(gòu)應(yīng)建立并維護(hù)規(guī)范的、涉及生產(chǎn)全過程的操作程序,確保加工過程不造成污染或交叉污染,并防止傳染性疾病的引入、傳染及傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

    3 關(guān)鍵生產(chǎn)物料的質(zhì)控要求

    根據(jù)原材料對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響程度、原材料的來源、生產(chǎn)以及對(duì)產(chǎn)品潛在的污染風(fēng)險(xiǎn),結(jié)合《中國(guó)藥典》(2015版)的要求,按風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分級(jí)管理。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶按第4級(jí)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,其他按照1、2級(jí)進(jìn)行管理(表1、2)。

    4 細(xì)胞庫(kù)的建設(shè)

    細(xì)胞庫(kù)的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供已標(biāo)定好的、細(xì)胞質(zhì)量相同的、能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞種子。

    4.1 原材料的選擇

    細(xì)胞培養(yǎng)液中不得使用人血清,如需使用人血白蛋白,則須使用有批準(zhǔn)文號(hào)的合格制品。

    消化細(xì)胞用的胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),證明其無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。特別應(yīng)檢測(cè)胰蛋白酶來源的動(dòng)物可能攜帶的病毒,如細(xì)小病毒等。

    用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或β-內(nèi)酰胺(β-Lactam)類抗生素。配制各種溶液的化學(xué)藥品應(yīng)符合《中國(guó)藥典》(二部)或其他相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

    表1 細(xì)胞培養(yǎng)過程關(guān)鍵物料材料等級(jí)劃分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

    表2 不同風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制要求

    4.2 細(xì)胞操作的環(huán)境要求

    細(xì)胞培養(yǎng)的操作應(yīng)符合中國(guó)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的操作;在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前,不得操作或接觸有感染性的微生物或動(dòng)物。

    4.3 人細(xì)胞庫(kù)的建立

    細(xì)胞庫(kù)為三級(jí)管理,即原始細(xì)胞庫(kù)(PCB)、主細(xì)胞庫(kù)(MCB)及工作細(xì)胞庫(kù)(WCB)。如為引進(jìn)的細(xì)胞,可采用主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)組成的二級(jí)細(xì)胞庫(kù)管理。在某些特殊情況下,也可使用主細(xì)胞庫(kù)一級(jí)細(xì)胞庫(kù)管理,但須得到國(guó)務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)。

    4.3.1原始細(xì)胞庫(kù)

    由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體,或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體,通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。在特定條件下,將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液,定量均勻分裝于安瓿,于液氮或-130 ℃以下凍存,即為原始細(xì)胞庫(kù),供建立主細(xì)胞庫(kù)用。

    4.3.2主細(xì)胞庫(kù)

    取原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞,通過一定方式進(jìn)行傳代、增殖后均勻混合成一批,定量分裝,保存于液氮或-130 ℃以下。這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定,應(yīng)合格。主細(xì)胞庫(kù)用于工作細(xì)胞的制備,每個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的主細(xì)胞庫(kù)最多不得超過兩個(gè)細(xì)胞代次。

    4.3.3工作細(xì)胞庫(kù)

    工作細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞由主細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成。主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖, 達(dá)到一定代次水平,制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液,定量分裝于安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管,保存于液氮或-130 ℃以下備用,即為工作細(xì)胞庫(kù)。每個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的工作細(xì)胞庫(kù)必須限定為一個(gè)細(xì)胞代次。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批次制品。復(fù)蘇后細(xì)胞的代次水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。所制備的工作細(xì)胞庫(kù)必須經(jīng)檢定合格(見4.5“細(xì)胞檢定”中有關(guān)規(guī)定)后,方可用于生產(chǎn)。

    4.4 細(xì)胞庫(kù)的管理

    每種細(xì)胞庫(kù)均應(yīng)分別建立臺(tái)帳,記錄放置位置、容器編號(hào)、分裝及凍存數(shù)量、取用記錄等。細(xì)胞庫(kù)中的每支細(xì)胞安瓿或細(xì)胞凍存管均應(yīng)注明細(xì)胞系/株名、代次、批號(hào)、編號(hào)、凍存日期,儲(chǔ)存容器的編號(hào)等。

    凍存前細(xì)胞活力應(yīng)在90%以上,復(fù)蘇后細(xì)胞存活率應(yīng)不低于85%。凍存后的細(xì)胞,應(yīng)至少行一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期,檢查不同代次水平的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

    主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)分別存放。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。

    4.5 細(xì)胞檢定

    細(xì)胞檢定主要包括細(xì)胞鑒別、外源因子和內(nèi)源因子的檢查、致瘤性檢查等(表3)。必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞染色體核型檢查。這些檢測(cè)內(nèi)容對(duì)于主細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞和工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞及生產(chǎn)限定代次細(xì)胞均適用。

    細(xì)胞庫(kù)建立后應(yīng)至少對(duì)主細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞及生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行一次全面檢定。每次從主細(xì)胞庫(kù)建立一個(gè)新的工作細(xì)胞庫(kù),均應(yīng)按規(guī)定項(xiàng)目進(jìn)行檢定。

    表3 細(xì)胞檢定項(xiàng)目要求

    除考慮安全性指標(biāo)外,還應(yīng)充分考慮細(xì)胞的功能性指標(biāo)。如細(xì)胞在建庫(kù)過程中,細(xì)胞屬性的維持以及細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)水平都是需要考慮的關(guān)鍵指標(biāo)。

    5 與支架共建培養(yǎng)結(jié)束后的放行檢驗(yàn)

    與支架進(jìn)行共建培養(yǎng)后,對(duì)于細(xì)胞的放行檢驗(yàn)不容忽視。越來越多證據(jù)表明,支架對(duì)于細(xì)胞的微調(diào)控作用,會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生分化及代謝相關(guān)指標(biāo)的變化。因而,建立合理且可行的放行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是檢驗(yàn)組織工程產(chǎn)品有效且安全的保障。然而,鑒于細(xì)胞的特殊性,包括培養(yǎng)及儲(chǔ)存環(huán)境需要無(wú)菌,貨架期短等,無(wú)法如其他醫(yī)療器械一樣進(jìn)行放行檢驗(yàn)指標(biāo)的設(shè)立。

    對(duì)于帶細(xì)胞的組織工程產(chǎn)品的放行檢驗(yàn)指標(biāo),從有效性角度來說,應(yīng)至少包括細(xì)胞屬性標(biāo)志蛋白與細(xì)胞功能蛋白的檢測(cè),用以評(píng)估終產(chǎn)品中細(xì)胞的有效性發(fā)揮。安全性角度,應(yīng)從制劑及無(wú)菌兩方面進(jìn)行檢驗(yàn)。其中,制劑檢測(cè)至少包括內(nèi)毒素檢測(cè)、抗生素檢測(cè)及牛血清白蛋白檢測(cè)等。組織工程產(chǎn)品的活細(xì)胞特性決定了貨架有效期較短,而常規(guī)無(wú)菌檢查時(shí)間長(zhǎng),無(wú)法用體外培養(yǎng)法進(jìn)行無(wú)菌檢查?!熬淇倲?shù)檢測(cè)試紙”快速檢驗(yàn)法,15~24 h即可驗(yàn)證無(wú)菌,不失為一種理想的放行檢驗(yàn)無(wú)菌檢查方法。

    6 總結(jié)

    組織工程學(xué)的三要素是指材料、細(xì)胞、生長(zhǎng)因子。所以對(duì)于組織工程產(chǎn)品而言,細(xì)胞/干細(xì)胞是極為重要的。組織工程產(chǎn)品制備需要用細(xì)胞和生物材料在外部合理的培養(yǎng)環(huán)境下,構(gòu)建能夠植入人體進(jìn)行組織修復(fù)與替代的產(chǎn)品。細(xì)胞對(duì)于組織工程產(chǎn)品既是生產(chǎn)物料,也是產(chǎn)品組成成分。而且還要保持其特有的性能,才能保證植入人體后發(fā)揮其生物活性。當(dāng)然,對(duì)于細(xì)胞來講,保證其供體的安全性,操作的規(guī)范性至關(guān)重要[1]。本文總結(jié)了從供體到細(xì)胞培養(yǎng),到質(zhì)量控制的基本指標(biāo)。組織工程產(chǎn)品多樣,細(xì)胞來源也多樣,生產(chǎn)者應(yīng)該根據(jù)自己產(chǎn)品的特點(diǎn)制定質(zhì)量控制規(guī)程,以保證產(chǎn)品的安全性和有效性。

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