朱頂紅花器官離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株研究

摘要在添加 NAA或2，4 -D和 6 -BA 的MS 基本培養(yǎng)基中，以朱頂紅品種“檸檬冰糕”（Hippeastrum hybridum ‘lemon sorbet）的花器官為外植體進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別從子房壁、花瓣、胚珠的培養(yǎng)中誘導(dǎo)出無菌植株，并對(duì)再生植株后期的生長表現(xiàn)進(jìn)行幾年的持續(xù)觀察，認(rèn)為花器官培養(yǎng)是最有效的朱頂紅快速繁殖方式。

關(guān)鍵詞朱頂紅;花器官;離體培養(yǎng);再生植株

中圖分類號(hào)S682.2+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2020）15-0133-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.037

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Plant Regeneration Induced by in vitro?Culture of Flower Organs of Hippeastrum hybridum

LIU Baoyong

（Wuhan Landscape Research Institute， Wuhan， Hubei ?430081）

AbstractIn the MS medium supplemented with NAA or 2，4D and 6-BA， the floral organs of Hippeastrum hybridum ‘lemon sorbet were cultured in vitro，?and sterile plants were induced from ovary wall， petal and ovule culture， respectively.The growth performance of the regenerated plants was observed for several years， and it was considered that floral organ culture was the most effective way for rapid propagation of ?Hippeastrum hybridum.

Key wordsHippeastrum hybridum;Floral organs;In vitro?culture;Regenerated plant

基金項(xiàng)目武漢市園林局科研基金項(xiàng)目（武園發(fā)〔2015〕9 號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介劉寶勇（1962—），男，湖北隨州人，高級(jí)工程師，從事球根宿根類花卉和香味花卉研究。

收稿日期2019-12-17;修回日期2020-03-20

朱頂紅原產(chǎn)于南美，20世紀(jì)初引入我國，至20世紀(jì)末，歐洲朱頂紅育種工作取得長足發(fā)展，已培育出了大量的雜交園藝新品種，同時(shí)，大量新品種開始進(jìn)入我國，在我國這些年也得到較快的發(fā)展。經(jīng)過幾年對(duì)雜交朱頂紅（Hippeastrum hybridum）的引種栽培觀察，證明朱頂紅在武漢地區(qū)的適應(yīng)性十分良好，進(jìn)行露地栽培，炎熱的夏天休眠不明顯，寒冷的冬季只需稍加處理，就可以安全度過，不需要特別的精細(xì)管理。觀賞期很長，4—6月和9—11月各有一次盛花期，4—12月每月都陸續(xù)可以見到花開，且無花時(shí)觀葉效果也十分優(yōu)良。但是，目前種球主要還是靠進(jìn)口，價(jià)格仍然比較昂貴，大量的園林應(yīng)用受到很大的限制，另外一些珍稀品種，供給數(shù)量往往很少，常規(guī)繁殖效率低下，如何快速有效地進(jìn)行大量繁殖，降低應(yīng)用成本，是目前應(yīng)當(dāng)解決的一個(gè)重要問題。組織培養(yǎng)是一種行之有效的解決方法，目前，朱頂紅組織培養(yǎng)已有多年研究[1]，有采用種子下胚軸進(jìn)行培養(yǎng)的[2]，有選擇花梗、子房培養(yǎng)的[3]，也有采用幼嫩蒴果進(jìn)行培養(yǎng)的[4]。報(bào)道較多的是采用鱗莖鱗片進(jìn)行培養(yǎng)繁殖[5-10]，這種方法由于要消耗種球，代價(jià)較高，而且污染及褐化都比較嚴(yán)重，分化率低，分化較慢。

該試驗(yàn)以朱頂紅品種“檸檬冰糕”（Hippeastrum hybridum ‘lemon sorbet）的花器官為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，分別從子房壁、花瓣、胚珠的培養(yǎng)中獲得不同來源的無菌植株，并對(duì)組培苗后期的生長進(jìn)行幾年的持續(xù)觀察， 以獲得有效的朱頂紅快速繁殖方式。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為荷蘭產(chǎn)朱頂紅品種“檸檬冰糕”花器官，開花期間，現(xiàn)采集使用。試驗(yàn)采集一個(gè)花枝，共包含花及花蕾4個(gè)，其中

第一朵（花1）花已開過，花瓣已萎蔫，取用子房;第二朵（花2）為當(dāng)天初開的花朵，已完全開放，取用子房和花瓣;第三朵（花3）為大花蕾，蕾長8 cm，已經(jīng)開始顯色，取用子房、花瓣及花藥;第四朵（花4）為小花蕾，蕾長5 cm，取用子房、花瓣及花藥?；ㄋ幏謩e進(jìn)行單獨(dú)接種和與花瓣混合接種。

1.2方法

1.2.1取材接種及無菌苗誘導(dǎo)。

完整切取朱頂紅的花及花蕾，已經(jīng)萎蔫及盛開的花朵，將花瓣上部切去舍棄，用洗潔劑小心洗凈，流水充分沖洗干凈后，為了便于后面的滅菌，將大的花蕾上半部分也用干凈的刀片切去一些，一起放入玻璃培養(yǎng)瓶中;用75%乙醇沖洗30～60 s，然后以10%的次氯酸鈉溶液滅菌10 min，無菌水沖洗3遍以上。子房縱向剖切為3瓣，連同胚珠一起接種，花瓣切取0.5 cm，根據(jù)大小縱剖為4～8瓣，花藥直接接種或者橫切一下溢出花粉粒，分別接種到不同的培養(yǎng)集中進(jìn)行培養(yǎng)。接種日期為2014年12月24日。

培養(yǎng)溫度為25 ℃，三色生物照明燈照明，光照強(qiáng)度1 500～2 500 lx，光照時(shí)長12 h/d。

1.2.2培養(yǎng)基選用。基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖，瓊脂粉6～7 g/L，添加不同濃度和種類的植物生長調(diào)節(jié)劑，此次試驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑添加情況見表1。

1.2.3繼代培養(yǎng)與增殖。外植體分化出芽長葉，在基部形成小鱗莖，且逐步長大后，取出新長出的較大鱗莖，進(jìn)行縱向切割，根據(jù)球的大小切分為2～8瓣，小球則直接轉(zhuǎn)接，繼代培養(yǎng)基仍選用原MS培養(yǎng)基，增殖選用M4號(hào)培養(yǎng)基，蔗糖、瓊脂粉含量不變，培養(yǎng)溫度、光照條件不變。

1.2.4生根。

葉片長出形成小鱗莖后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基上都能夠直接生長出根，未另外進(jìn)行生根培養(yǎng)，待球莖長至0.5～1.0 cm即可出瓶上盆種植。另外，已經(jīng)形成健壯小鱗莖的植株，即使沒有根，種植后也能成活。

1.2.5出瓶上盆種植。

小苗生根以后即可出瓶上盆，出瓶種植之前未進(jìn)行開瓶煉苗。將培養(yǎng)苗從瓶中取出，把培養(yǎng)基清除洗凈，分開小種球，種植在事先準(zhǔn)備好的栽培基質(zhì)中，基質(zhì)組成配比為泥炭∶蚯蚓土（1∶1），種植容器為直徑13 cm的紅黑雙色塑料盆缽，每盆一苗，種植時(shí)間為2016年3月30日。1年后換入直徑為18 cm紅黑雙色塑料盆中。

1.2.6后期管理。后期按朱頂紅常規(guī)栽培方法種植，未作其他特殊處理。

2結(jié)果與分析

2.1無菌苗誘導(dǎo)情況不同外植體和培養(yǎng)基組合的培養(yǎng)情況見表2。

從表2可以看出，在M1培養(yǎng)基中由花2的子房壁誘導(dǎo)出了無菌苗;在M2培養(yǎng)基中由花3的花瓣誘導(dǎo)出了無菌苗，還由花4的胚珠誘導(dǎo)出了大量的無菌苗;在M3培養(yǎng)基中由花3的花瓣誘導(dǎo)出了無菌苗，由花4的子房壁誘導(dǎo)出了無菌苗;在M4、M5培養(yǎng)基中未誘導(dǎo)出無菌苗，花1未誘導(dǎo)出苗。

2.1.1滅菌效果。

該試驗(yàn)共使用花朵花蕾4個(gè)，接種21瓶，其中，已經(jīng)萎蔫的花朵一個(gè)接種2瓶全部污染，初開的花朵和小花蕾接種的材料中各有1瓶污染，污染全部為子房材料，花瓣的污染率為0，表明除萎蔫的花朵容易污染外，初開的花朵以及花蕾滅菌效果均良好。

2.1.2花朵不同部位作為外植體的誘導(dǎo)效果。

2.1.2.1子房。分別由子房壁和胚珠誘導(dǎo)出無菌苗。

由子房壁誘導(dǎo)出無菌苗較慢，接種30 d左右，可見子房明顯長大，脂肪壁表面逐漸變得凹凸不平，形成愈傷組織，然后部分愈傷組織再分化出苗，該試驗(yàn)中3朵花均產(chǎn)生了愈傷組織，但生長較慢，在切口處容易變成褐色，但對(duì)子房壁的進(jìn)一步生長影響不大，其中2朵花的子房壁愈傷組織再分化，生長出苗（圖1）。

在最小一個(gè)花蕾的子房培養(yǎng)中，子房壁逐漸變褐色，但大量胚珠慢慢生長變綠，并且進(jìn)一步生長出小芽，獲得到大量無菌苗（圖2）。

2.1.2.2花瓣。在2個(gè)未開的花蕾花瓣上均誘導(dǎo)出無菌苗。接種后14 d左右，可見花瓣組織有明顯增大現(xiàn)象，30 d左右，出綠色小點(diǎn)，小點(diǎn)逐漸長大，形成許多小芽，60 d左右小芽葉片可以長到3 cm以上，將這些小芽分開，繼續(xù)分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)，隨著葉片長大，在基部形成小鱗莖，且逐步長大（圖3）。將培育出的小種球再進(jìn)行縱向切割，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)一步進(jìn)行增殖培養(yǎng)，可以快速增加個(gè)體數(shù)量。已經(jīng)完全盛開的花朵沒有誘導(dǎo)出苗，花蕾花瓣的上半部較薄部分也沒有誘導(dǎo)出苗。

2.1.2.3花藥。所有的花藥，不論是單獨(dú)接種，還是和花瓣一起接種，均未分化獲得到無菌苗。

2.2組培苗后期表現(xiàn)

朱頂紅上盆成活率高，上盆前未進(jìn)行煉苗處理，成活率仍然達(dá)100%。2016年3月30日出瓶上盆，上盆后一年，植株于2017年4月5日初次開花，首次開出的第一朵花為畸形花，花瓣呈葉片狀，全綠色;當(dāng)年4月12日第2朵花開放，顏色接近正常的黃色，個(gè)別花瓣仍有畸形現(xiàn)象;5月23日第3次開放，整個(gè)花都已經(jīng)正常。以后所開之花大部分為正?；?。

由組培苗獲得的植株，側(cè)芽增殖旺盛，萌芽多。對(duì)來源于組培苗、分株苗及原進(jìn)口商品球苗的萌芽情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下：

單株的萌芽數(shù)量（含主芽）為6.2、2.4、4.8。

其中組培苗為出瓶上盆種植3年的植株，分株苗為2015年分株上盆種植4年的植株，原球苗為荷蘭原產(chǎn)進(jìn)口商品球，露地栽培5年。品種均為“檸檬冰糕”，均為連續(xù)取樣10株。組培苗栽培3年后，其萌芽數(shù)量最高為12個(gè)，最少也有2個(gè)，平均為6個(gè)以上，遠(yuǎn)高于分株苗的萌芽數(shù)量，而且明顯比商品球在地面種植5年以后產(chǎn)生的萌芽還要多。與此同時(shí)，花枝也多，圖4顯示一盆組培苗在2019年同時(shí)開花4枝。

3結(jié)論與討論

采用花器官為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)是朱頂紅快速繁殖的一種非常有效的方法，與其他繁殖方法相比，具有十分明顯的優(yōu)點(diǎn)。

（1）材料來源充足，成本低廉，切取葉片對(duì)植物的光合作用會(huì)有影響，切取鱗片更是會(huì)破壞種球，影響植株的生長，而切取花枝對(duì)植物生長沒有任何影響，為了使種球增大，往往還需要切去花枝，可以利用這些材料作為充足的外植體來源，幾乎不需要什么成本。

（2）簡(jiǎn)化了滅菌操作，滅菌效果好，污染率低。也曾采用小子球切割培養(yǎng)，因?yàn)榍蚋谕林猩L，大多是帶菌體，菌絲侵入組織內(nèi)部，處理較為麻煩，滅菌效果不佳，培養(yǎng)種材料很容易帶菌，污染率高。而花器官培養(yǎng)，僅使用最普通的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅菌，就能達(dá)到很好的滅菌效果，污染率極低。

（3）無菌苗誘導(dǎo)容易，誘導(dǎo)效率高。該試驗(yàn)中對(duì)培養(yǎng)基并沒有進(jìn)行復(fù)雜的正交試驗(yàn)，培養(yǎng)基也沒有添加過多復(fù)雜成分，僅僅設(shè)計(jì)了幾種比較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，即成功獲得多瓶不同來源的無菌苗。在其后不同品種試驗(yàn)中，從花總梗、花柄中也都成功誘導(dǎo)出了無菌苗，表明用花作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)無菌苗，簡(jiǎn)單而且高效?；ü?、花柄以及子房壁的培養(yǎng)中，經(jīng)常出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，大多數(shù)采用活性炭或者維生素C進(jìn)行處理[3]，該試驗(yàn)不加任何添加物也能順利獲得無菌苗。

（4）用花瓣作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，不需要經(jīng)過脫分化產(chǎn)生大量愈傷組織然后進(jìn)行再分化出苗的過程，直接從培養(yǎng)物表面出芽，出苗快，生長也快。

（5）通過未受精胚株培養(yǎng)，也可以直接獲得大量的胚珠苗，而且，從中有可能得到單倍體植株，通過加倍可以快速獲得純合個(gè)體，這對(duì)于朱頂紅的新品種培育具有十分重要的價(jià)值。

（6）與分球以及播種相比，組培苗生長快速，開花周期短，最快只有1年時(shí)間就可以開花，2年即可成為商品苗。而通過分球繁殖的植株，同樣大小的子球至少需要培育2年才能夠開花，通過播種繁殖的小苗，必須滿3年才能開花。

（7）通過花器官組織培養(yǎng)獲得的植株萌芽較多，種球增殖力強(qiáng)，配合分株繁殖，可以獲得更多的子球，繁殖效率得到進(jìn)一步提高。

（8）通過組織培養(yǎng)培育出的種苗，可以穩(wěn)定繼承其母本的特征，表現(xiàn)穩(wěn)定，植株健壯，著花多而整齊，株型也好。

綜上所述，通過花器官進(jìn)行培養(yǎng)是獲得朱頂紅無菌苗，進(jìn)行朱頂紅快速繁殖的有效途徑。

參考文獻(xiàn)

[1]

沈苗苗，于曉南.朱頂紅組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（10）：135-138.

[2] 紀(jì)春艷.朱頂紅種子下胚軸離體培養(yǎng)與植株再生的研究[J].北方園藝，2008（6）：190-191.

[3] 王宇，江黎.朱頂紅花梗與子房組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2017（2）：79-81.

[4] 姜明蘭，鐘文田.朱頂紅愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，1984（1）：37-38.

[5] 劉鐸，梁樹樂.朱頂紅快繁無菌體系建立的研究[J].現(xiàn)代園藝，2018（3）：23-25.

[6] 張松，達(dá)克東，曹辰興，等.朱頂紅離體培養(yǎng)快速繁殖體系及胚狀體發(fā)生[J].園藝學(xué)報(bào)，2002，29（3）：285-287.

[7] 婁曉鳴，周玉珍，孔賢，等.雜交朱頂紅鱗莖不定芽誘導(dǎo)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（34）：16769-16770.

[8] 龔雪琴，由翠榮，曲復(fù)寧，等.朱頂紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（2）：381-386.

[9] 邵素娟.朱頂紅快繁技術(shù)研究[D].上海：上海交通大學(xué)，2008：33-43.

[10] 吳永朋，原雅玲，李淑娟，等.朱頂紅鱗莖扦插研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，62（4）：45-48.