首次從喜馬拉雅旱獺分離布魯氏菌與鑒定

謝 輝，薛紅梅，于守鴻，徐立青，馬 麗，楊旭欣，張愛萍

布魯氏菌病由布魯氏菌引起的人獸共患病，嚴(yán)重危害人類健康和畜業(yè)發(fā)展。布魯氏菌廣泛分布于野生動物中[1-3]，如野豬、野牛等可造成布病自然疫源地形成的原因，曾報道新疆地區(qū)旱獺布菌血清學(xué)調(diào)查感染率為0.92%[4]， 1982年在青海海北州海晏縣檢測340份旱獺，血清學(xué)檢測陽性率為3.25%，1986年在果洛州達(dá)日縣檢測喜馬拉雅旱獺1 117份，血清學(xué)檢測1.88%，1994年在海西州天峻縣檢測80份旱獺血清樣品，陽性率2.5%[5-7]，可以推斷喜馬拉雅旱獺可以感染布病，但未能從旱獺體內(nèi)分離出布魯氏菌。2016年我們檢測喜馬拉雅旱獺245份，陽性率5.31%，并在血樣品中分離出一株疑似布魯氏菌株。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣品 為旱獺全血，喜馬拉雅旱獺全血245份采用虎紅平板凝集反應(yīng)(RPTB)試管凝集反應(yīng)(SAT),噬菌體試驗(yàn)及染料抑菌試驗(yàn)。

1.1.2試劑 改良布魯氏菌肝浸液培養(yǎng)基本所自制，雙相培養(yǎng)基(20160430)布魯氏菌虎紅凝集試驗(yàn)抗原(2016-1)、凝集試管抗原(2016-2)、因子血清(A.M.R)、噬菌體(Tb、Wb、Bk)由青島眾創(chuàng)生物科技有限公司提供，柯氏染色由索寶萊生物科技有限公司提供，醋酸鉛紙條、硫堇紙片、復(fù)紅紙片由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

鑒定用參考菌株：國家標(biāo)準(zhǔn)菌株牛104、羊M5、豬S2均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.2方 法

1.2.1血清學(xué)檢測 使用虎紅平板凝集試驗(yàn)對旱獺血清進(jìn)行布魯氏菌陽性抗體的初篩，陽性血清行布氏菌凝集試驗(yàn)，按照《布氏菌試管(GB/T18646)》判定結(jié)果。

1.2.2細(xì)菌分離 無菌操作采集旱獺心臟全血，取5 mL加入改良肝浸液雙相培養(yǎng)基及市售雙相血培養(yǎng)基，45°傾斜，使血液均勻分布在瓊脂斜面上，置37 ℃溫箱培養(yǎng)，觀察30 d。

1.2.3主要鑒定方法 1) 柯絲羅夫斯基法及革蘭氏染色法，觀察菌體形態(tài)、染色特征； 2)對CO2的需要；3)H2S產(chǎn)生測定；4)染料抑菌試驗(yàn)；5)A、M、R單因子血清凝集試驗(yàn)，結(jié)果對照布魯氏菌屬分類表。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)檢測 共檢測245份旱獺血清，其中13份血清虎紅平板凝集試驗(yàn)及試管凝集試驗(yàn)均呈陽性，血清抗體最高滴度為1∶400。

2.2細(xì)菌分離 采集旱獺全血先接種于血液增菌液后培養(yǎng)于改良肝浸液培養(yǎng)基和雙相血培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，第7 d可見優(yōu)化肝浸液培養(yǎng)基上生長無色透明、圓形濕潤菌落，直徑為0.6～1 mm，表面凸起，邊緣整齊，在改良肝浸液瓊脂上，培養(yǎng)物呈分散狀，疑似布魯氏桿菌。

2.3鑒 定

2.3.1菌落與菌體形態(tài) 菌落為無色透明、圓形、稍隆起、表面光滑、均質(zhì)樣，菌體為革蘭氏陰性球桿菌，呈單個排列，柯氏染色為紅色，見圖1。

圖1 柯氏染色倒置顯微鏡100倍34號菌株菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strain no.34 100 times under an inverted microscope with kirschner staining

2.3.2種型鑒定 經(jīng)布魯菌常規(guī)系列鑒定，并對照布魯氏菌屬的分類表，確定為羊種生物3型布魯氏菌，見表1。

表1 喜馬拉雅旱獺布菌鑒定表Tab.1 Identification of brucella from the Himalayan marmot

3 討 論

根據(jù)34號菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色特征、生長情況以及某些生化特性, 與羊種布魯氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株特性一致，初步鑒定34號菌株為羊種布氏菌。從喜馬拉雅旱獺體內(nèi)分離出羊種布魯氏桿菌，這在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過對喜馬拉雅旱獺布菌血液初分離時，由于雜菌生長抑制布魯菌，菌落發(fā)育不良，需增加刺激目的菌的試劑同時抑制雜菌，再進(jìn)行分純培養(yǎng)[8]，如直接全血接種培養(yǎng)基，菌株生長緩慢[9-10]，初培養(yǎng)時不需要CO2,最適宜溫度為37 ℃, 34號菌增菌后在改良肝浸液培養(yǎng)基生長良好。喜馬拉雅旱獺布菌在一般培養(yǎng)基上不易生長，在優(yōu)化的肝浸液培養(yǎng)基上生長良好，檢出率較高，13份抗體陽性血液有1份檢出細(xì)菌。

1985年WHO布魯氏菌委員會將布魯氏桿菌分為6個種19個生物型，我國已分離15個生物型，分別為羊種布魯氏菌3個型，牛種布魯氏菌8個型，豬種布魯氏菌2個型，綿羊附睪種布魯氏菌和犬種布魯氏菌個1個型，其中羊布魯氏菌的致病力最強(qiáng)[11-13]傳染面廣,危害嚴(yán)重。從喜馬拉雅旱獺體內(nèi)分離羊種布魯氏菌對于研究該病的致病性、流行特點(diǎn)、探討青藏高原喜馬拉雅旱獺對布病傳播的意義，對了解青藏高原布魯氏桿菌保存機(jī)理及疫情變化提供理論依據(jù)。

喜馬拉雅旱獺是鼠疫菌的主要宿主，本試驗(yàn)從喜馬拉雅旱獺血液中分離出布魯氏桿菌，這一發(fā)現(xiàn)對于鼠防人員從事血清樣本檢測時，在生物安全防護(hù)方面提供新的思路。

利益沖突：無