激光誘導(dǎo)擊穿光譜的油茶炭疽病檢測(cè)

劉燕德， 高 雪， 姜小剛， 高海根， 林曉東， 張 雨， 鄭藝?yán)?/p>

華東交通大學(xué)機(jī)電與車(chē)輛工程學(xué)院， 光機(jī)電技術(shù)及應(yīng)用研究所， 江西 南昌 330013

引 言

油茶是我國(guó)南方特有的食用油料樹(shù)種， 具有良好的生態(tài)經(jīng)濟(jì)效益。 目前， 產(chǎn)業(yè)面臨的最大問(wèn)題是如何提高油茶種植區(qū)產(chǎn)量。 油茶產(chǎn)量與油茶樹(shù)生長(zhǎng)的健康狀態(tài)密切相關(guān)， 所以檢測(cè)油茶病害是提高油茶產(chǎn)量的重要保障。 油茶炭疽病是長(zhǎng)江流域以南各省油茶栽培區(qū)普遍發(fā)生的一種重要病害， 病害嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起落果、 落蕾、 枝梢枯死， 甚至整株衰亡的現(xiàn)象[1]。 因此， 找到一種快速、 有效、 無(wú)損的油茶炭疽病檢測(cè)方法， 對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

油茶主要是大面積種植， 不可避免的會(huì)受到病害侵襲。 病害嚴(yán)重威脅著整個(gè)油茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。 目前， 病害檢測(cè)成為了大量研究人員討論的熱點(diǎn)問(wèn)題。 熊朝偉[2]、 楊婷[3]等根據(jù)分析油茶炭疽病病原菌， 檢測(cè)油茶炭疽病。 這種檢測(cè)方法雖然具有較高的精度和靈敏度， 但對(duì)試驗(yàn)研究人員的技術(shù)要求高， 他們必須具備分析病菌能力、 且樣品制備復(fù)雜、 試驗(yàn)產(chǎn)物對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。 還有一些研究者嘗試著用無(wú)損檢測(cè)方法， 如伍南[1]等采用可見(jiàn)-近紅外光譜技術(shù)和高光譜技術(shù)檢測(cè)油茶炭疽病。

激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)[4]是一種可同時(shí)檢測(cè)多元素的簡(jiǎn)便、 快速、 無(wú)損分析技術(shù)， 被靈活地應(yīng)用在農(nóng)業(yè)檢測(cè)方面[5]。 趙賢德等利用納米增強(qiáng)LIBS技術(shù)檢測(cè)蘋(píng)果表面農(nóng)藥殘留， 檢測(cè)到的毒死蜱農(nóng)藥檢測(cè)限最低為1.61 μg·cm-2(見(jiàn)本刊39卷7期)； Jull[6]等采用LIBS技術(shù)對(duì)新鮮牧草和干燥牧草的營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行了預(yù)測(cè)， 結(jié)果表明LIBS可以用來(lái)評(píng)估新鮮牧場(chǎng)的營(yíng)養(yǎng)水平； Shukla[7]等利用LIBS技術(shù)檢測(cè)了五種不同綠葉蔬菜中的礦物質(zhì)分布。 Wang[8]等采用LIBS和判別分析(DA)相結(jié)合的方法， 對(duì)6種茶葉進(jìn)行了分析鑒定， 其平均正確識(shí)別率高達(dá)95.33%。

目前， LIBS在油茶病害檢測(cè)應(yīng)用很少， 鑒于LIBS在眾多植物病害檢測(cè)方法中比較新穎和突出， 提出了基于LIBS的油茶炭疽病檢測(cè)方法。 油茶葉片的生長(zhǎng)情況直接反映油茶樹(shù)及整個(gè)種植區(qū)油茶的健康程度。 以油茶健康葉片和感染炭疽病的葉片為研究對(duì)象， 研究健康葉片和感染炭疽病葉片的LIBS及其光譜響應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

油茶的健康葉片和感染炭疽病的葉片在2019年6月江西省南昌市的油茶林分散的采集了具有代表的兩種葉片。 健康葉片指葉片表面光滑無(wú)任何病斑， 感染炭疽病葉片指黑褐色病斑的面積占總面積的1/4以上， 分別采摘100片。 由于天氣炎熱， 將采集的新鮮葉片裝入保鮮袋中， 并將其與冰袋放在一起帶回實(shí)驗(yàn)室， 可以保證葉片的新鮮程度， 用于LIBS光譜采集實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 首先， 用實(shí)驗(yàn)室制備的去離子水反復(fù)沖洗葉片表面3次， 目的是去除油茶葉片表面上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一些污漬； 然后， 用吸水紙擦干， 放置通風(fēng)處?kù)o置兩小時(shí)自然風(fēng)干， 減少葉片表面水珠對(duì)LIBS的影響； 最后， 裝袋并分類(lèi)標(biāo)號(hào)。

1.2 LIBS設(shè)備

實(shí)驗(yàn)采用的LIBS設(shè)備是海洋光學(xué)的MX2500+， 如圖1所示為L(zhǎng)IBS系統(tǒng)原理圖。 Q開(kāi)關(guān)Nd∶YAG激光器激發(fā)出脈沖寬度為納秒量級(jí)的較高能量激光， 經(jīng)反射后， 由透鏡聚焦到油茶葉片表面， 剝離葉片表面微量物質(zhì)形成等離子體， 由光纖收集后傳輸給5個(gè)通道的多通道光譜儀中， 然后通過(guò)光譜儀配套的MaxLIBS軟件設(shè)置參數(shù)， 進(jìn)行元素的波長(zhǎng)與信號(hào)強(qiáng)度的光譜采集。

圖1 LIBS系統(tǒng)原理圖

激光能量設(shè)置為50 mJ， 光譜儀的波長(zhǎng)范圍為198.71～727.69 nm， 光學(xué)分辨率0.1 nm， 延遲時(shí)間設(shè)為2 μs。 每個(gè)樣本分散采集6個(gè)LIBS光譜數(shù)據(jù)值， 健康油茶葉片在避開(kāi)葉脈處采集， 感染炭疽病的葉片在病斑周?chē)?患病初期)采集， 將每個(gè)葉片采集到的LIBS光譜數(shù)據(jù)求其平均值， 目的是減小誤差， 同時(shí)降低油茶葉片不平整對(duì)樣品的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

LIBS光譜信號(hào)受激光器激光能量的波動(dòng)、 光譜儀分辨率的差異、 外部環(huán)境的差異以及樣品不均勻等因素影響[9]， 為了有效地消除或減弱這些干擾信息， 對(duì)LIBS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜預(yù)處理。 通過(guò)對(duì)比分析了Savitzky-Golay卷積平滑法、 一階導(dǎo)數(shù)和多元散射校正(MSC)三種光譜預(yù)處理方法， 最終發(fā)現(xiàn)MSC的預(yù)處理效果最好。

多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)主要應(yīng)用于固體漫反射和漿狀物透(反)射光譜中， 目的是消除顆粒分布不均勻及顆粒大小產(chǎn)生的散射影響。 MSC算法是基于一組樣品的光譜陣進(jìn)行運(yùn)算的， 具體算法如式(1)

xMSC=(x-b)

(1)

其中，x和b是通過(guò)計(jì)算樣品的平均光譜， 并將x與進(jìn)行線性回歸：x=b0， 用最小二乘法求得x和b的值。

根據(jù)大量學(xué)者的研究文獻(xiàn)和NIST(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院)的標(biāo)準(zhǔn)原子光譜數(shù)據(jù)庫(kù)， 預(yù)選光譜Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七條LIBS光譜為分析油茶炭疽病的譜線。 這些微量元素與油茶葉片組織有內(nèi)在的相關(guān)性， 即這些微量元素有可能區(qū)分出健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片。 采用軟件Unscrambler 9.7中的主成分分析法(principal component analysis， PCA)和偏最小二乘判別分析[10](partial least square discriminant analysis， PLS-DA)對(duì)LIBS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉片LIBS光譜特征分析

圖2為Si和Fe的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實(shí)線表示健康油茶葉片光譜。 在波長(zhǎng)251.432和252.285 nm處分別觀察到Si和Fe的特征峰， 從圖中可以發(fā)現(xiàn)健康油茶葉片中Si的特征峰強(qiáng)度明顯大于感染炭疽病油茶葉片中Si的特征峰。 這種差異歸因于Si在植物生長(zhǎng)過(guò)程中所起的作用： Si是油茶生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分， 可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)， 提高產(chǎn)量和品質(zhì)； Si還具有抵抗病原菌侵襲植物的作用。 健康油茶樹(shù)中大量的Si元素起到抗病作用， 與之相反， 感染炭疽病的油茶葉片中Si含量低， 受炭疽病侵害。

圖3是Fe和Mn的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實(shí)線表示健康油茶葉片的光譜。 觀察到Fe和Mn譜線： Fe(Ⅰ)385.991 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm。 從Fe的三個(gè)特征峰可以明顯的觀察到， 健康油茶葉片中Fe的特征峰強(qiáng)度高于感染炭疽病油茶葉片中Fe的特征峰強(qiáng)度。 原因是Fe是形成葉綠素必須的微量元素， 健康油茶葉片中含有的大量Fe作用于細(xì)胞呼吸和代謝， 而感染炭疽病的油茶葉片的表面上出現(xiàn)病斑且病斑周?chē)实S色， 出現(xiàn)缺鐵變黃的癥狀。

圖2 油茶葉片在250～254 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)Si和Fe的LIBS光譜

圖3 油茶葉片的Fe和Mn的LIBS光譜

圖4是Mn的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實(shí)線表示健康油茶葉片的光譜。 從圖3和4中可以明顯地觀察到Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm的特征譜線。 同樣可以發(fā)現(xiàn)健康油茶葉片中Mn的特征峰強(qiáng)度明顯大于感染炭疽病油茶葉片中Mn的特征峰強(qiáng)度。 這是因?yàn)镸n是葉綠體的組成部分， 是維持葉綠體結(jié)構(gòu)所必需的微量元素， 當(dāng)葉片嚴(yán)重缺錳時(shí)， 葉面會(huì)出現(xiàn)黑褐色細(xì)小斑點(diǎn)， 并逐漸擴(kuò)大， 散布于整個(gè)葉片。 由感染炭疽病油茶葉片的外觀可推斷感染炭疽病的油茶葉片缺錳， 所以該葉片中Mn的特征峰強(qiáng)度比較低。

圖4 油茶葉片在278～282 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)Mn的LIBS光譜

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 分別挑選了炭疽病病斑面積占葉片總面積比例不同的LIBS光譜圖如圖5所示。 A代表炭疽病病斑面積占總面積1/4以下的LIBS光譜， B代表病斑面積占總面積1/4～2/4的LIBS光譜， C代表病斑面積占總面積2/4～3/4的LIBS光譜， D代表病斑面積占總面積3/4以上的LIBS光譜。 從圖中可以清晰地發(fā)現(xiàn)葉片表面上病斑面積越小其對(duì)應(yīng)的特征峰強(qiáng)度就越大， 其中病斑面積在1/4～2/4和2/4～3/4的LIBS光譜強(qiáng)度差異很小， 很難區(qū)分。 但從光譜的總體趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)葉片LIBS光譜特征峰強(qiáng)度隨著病斑面積的增大而減小。

圖5 四種炭疽病病斑面積不同的LIBS光譜圖

綜合上述健康油茶葉片中Si， Fe和Mn的特征峰強(qiáng)度明顯高于感染炭疽病的油茶葉片中Si， Fe和Mn的特征峰強(qiáng)度。 且油茶葉片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信號(hào)強(qiáng)度與葉片的健康狀態(tài)呈線性關(guān)系， LIBS信號(hào)強(qiáng)度隨著葉片的病害狀態(tài)加重逐漸降低。 故選用Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七條特征光譜對(duì)油茶葉片的健康和感染炭疽病的兩種情況進(jìn)行分析。

2.2 健康和染病的油茶葉片LIBS光譜的PCA分析

為了更清晰地區(qū)分健康和感染炭疽病的油茶葉片， 選用Si(251.432 nm)， Fe(252.285， 259.837和385.991 nm)， Mn(260.568， 279.482和280.108 nm)的特征峰進(jìn)行PCA分類(lèi)。 主成分個(gè)數(shù)設(shè)置為7個(gè)， 特征變量選取了七段光譜波段： 251.429 9～251.531 4， 252.241 4～252.342 7， 259.791 3～259.891 3， 385.957 7～386.044 3， 260.540 5～260.640 3， 279.398 2～279.494 3和280.070 1～280.166 0 nm。 由于選取數(shù)據(jù)的變量維數(shù)較多， 為了更好地從圖中判別兩種葉片光譜的差異性， 建立了三維的PCA分類(lèi)模型如圖6所示， 其中PC1， PC2和PC3的貢獻(xiàn)率分別為80%， 12%和6%。 紅色圓代表健康油茶葉片， 藍(lán)色三角代表稈染炭疽病的油茶葉片， 從圖中可以清晰的觀察到PCA分類(lèi)方法可以很好的對(duì)健康和感染炭疽病的油茶葉片進(jìn)行分類(lèi)， 其中有少數(shù)的葉片光譜區(qū)分的不是很明顯， 可能原因是感染炭疽病的葉片表面上患病面積較小， 屬于患病初期， 微量元素含量變化較小， 與健康油茶葉片中微量元素的含量比較接近。

圖6 健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片的PCA分析

2.3 基于偏最小二乘的油茶葉片健康狀態(tài)判別模型研究

使用122個(gè)樣品用于判別模型建立， 其中健康油茶葉片59個(gè)， 感染炭疽病的油茶葉片63個(gè)。 首先人為設(shè)定健康油茶樣品類(lèi)別為2， 感染炭疽病的油茶樣品類(lèi)別為-2， 然后按照3∶1的比例將油茶葉片隨機(jī)分為建模集和預(yù)測(cè)集兩部分， 建模集有92個(gè)樣品(健康葉片43個(gè)， 感染炭疽病葉片49個(gè))， 預(yù)測(cè)集有30個(gè)樣品(健康葉片16個(gè)， 感染炭疽病的14個(gè))。 如圖7所示， 在PLS-DA建模集模型中， 誤判樣品數(shù)為4個(gè)， 誤判率為4.3%； PLS-DA預(yù)測(cè)集模型中， 誤判樣品個(gè)數(shù)為3個(gè)， 誤判率為10%。 兩個(gè)判別模型的識(shí)別率都高于90%以上， 能夠較好的將健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片分類(lèi)。

圖7 偏最小二乘判別分析模

3 結(jié) 論

分析了油茶葉片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信號(hào)特點(diǎn)， 得出的結(jié)論是： 這三種微量元素的LIBS信號(hào)的特征峰強(qiáng)度與油茶葉片感染炭疽病的等級(jí)(健康葉片為0級(jí))具有相關(guān)性， 隨著等級(jí)的增加， LIBS信號(hào)特征峰強(qiáng)度逐漸降低。 另外， LIBS光譜線結(jié)合MSC光譜預(yù)處理方法和PCA分類(lèi)方法對(duì)健康和感染炭疽病的油茶葉片進(jìn)行分類(lèi)， 可以很好地區(qū)分健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片。 進(jìn)一步利用PLS-DA進(jìn)行建模判別， 模型的識(shí)別率均高于90%以上， 也可以較好地區(qū)分油茶葉片的健康和染病兩種狀態(tài)。

研究顯示， 采用激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)結(jié)合主成分分析、 偏最小二乘判別分析法識(shí)別油茶炭疽病葉片具有一定可行性。 為植物樣品檢測(cè)微量元素和營(yíng)養(yǎng)元素提供了參考， 同時(shí)也為L(zhǎng)IBS的應(yīng)用提供了參考。