威蘭膠發(fā)酵液脫除菌體的酶解工藝研究

劉建國，譚雯斐，姚傳凱，朱虎

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東青島266580)

威蘭膠是一類微生物多糖[1]，因其具有高穩(wěn)定性、高粘度、剪切稀釋性等優(yōu)異特性，使其成為繼黃原膠和結(jié)冷膠之后更具市場前景的微生物胞外多糖[2]。另外，由于威蘭膠發(fā)酵液粘度高，雜質(zhì)多，導(dǎo)致威蘭膠現(xiàn)有提取工藝(如醇析法、鹽醇析法、膜分離法等)效率低下，分離成本高[3]。特別是經(jīng)上述提取工藝獲得的威蘭膠產(chǎn)品中含有大量的菌體及雜蛋白，限制了其在食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。

本文選用鞘氨醇單孢桿菌(Sphingomonassp.WG)作為威蘭膠的生產(chǎn)菌株[5-6]，利用溶菌酶為催化劑，對脫除威蘭膠發(fā)酵液中菌體的酶解工藝進(jìn)行了深入研究，獲得了最適反應(yīng)條件，為最終的威蘭膠產(chǎn)品在醫(yī)藥、化妝品及食品行業(yè)中的應(yīng)用奠定創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

鞘氨醇單孢桿菌：由作者所在實(shí)驗(yàn)室從海水樣品中篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號：CCTCC No.M2013161)。

培養(yǎng)基組成：酵母膏2 g/L，葡萄糖40 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.1 g/L，pH調(diào)為7.0～7.2。

1.1.2 試劑

溶菌酶(10 000 U/mg，美國Sigma公司)，乙醇(體積分?jǐn)?shù)95 %，工業(yè)級)，三氯乙酸、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂等購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；HYG-C型多功能組合搖床(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；3-15K型離心機(jī)(德國Sigma公司)；RET BASIC型加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；MS 3型漩渦混合器(德國IKA公司)；DHG-9146型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；IDK13-2006型低溫恒溫槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將鞘氨醇單孢桿菌種子液以體積分?jǐn)?shù)5 %轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中，在32.5 ℃、175 r/min下發(fā)酵72 h得到黃色粘稠狀的威蘭膠發(fā)酵液。

1.3.2 菌體含量測定

本文利用三氯乙酸溶液(5 %)提取菌體中的總核酸進(jìn)行菌體含量測定，操作過程如下：

取威蘭膠發(fā)酵液(或溶菌酶處理后的發(fā)酵液)5 mL，在室溫下離心15 min(12 000×g)，取沉淀；用5 mL去離子水將沉淀懸浮，充分混勻后再次離心，以去除殘留的培養(yǎng)基，重復(fù)此清洗過程3次，獲得最終的沉淀物；然后，將沉淀物放入20 mL的三氯乙酸溶液(5 %)中混勻，在80 ℃水浴中靜置30 min后，立即放入冰水中冷卻；將混合溶液在4 ℃下離心10 min(8 000×g)，取上清液，測定其在260 nm波長處的吸光值(A260 nm)。

菌體去除率(η)根據(jù)式(1)、(2)計(jì)算獲得：

(1)

(2)

其中，CNA為總核酸濃度(mg/mL)；A260nm為吸光度；n為稀釋倍數(shù)；0.022為總核酸濃度為1 mg/mL時(shí)的吸光度。

1.3.3 威蘭膠的制備

取一定體積的發(fā)酵液，與5.5倍體積的酒精(95 %)充分混勻后，在室溫下放置6 h，經(jīng)過濾得到沉淀物；利用適量的酒精(95 %)對沉淀物進(jìn)行洗滌，以去除可能粘附的鹽離子和培養(yǎng)基，再分別經(jīng)過烘干、粉碎和篩分(200目)，獲得威蘭膠粉末。

1.3.4 溶菌酶降解菌體的反應(yīng)過程

本文利用溶菌酶降解威蘭膠中菌體的反應(yīng)過程在密閉的夾層玻璃反應(yīng)器中進(jìn)行。夾層中的恒溫水浴控制反應(yīng)的溫度，而攪拌速率則由磁力攪拌器加以調(diào)控。反應(yīng)開始前，先向反應(yīng)器中加入30 mL威蘭膠發(fā)酵液，設(shè)定反應(yīng)溫度及攪拌速率，然后加入適量的溶菌酶溶液，并利用橡膠塞將反應(yīng)器密封(減少溶劑的揮發(fā))，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對菌體去除率的影響

圖1 反應(yīng)溫度對菌體去除率的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the bacteria removal rate

反應(yīng)溫度對菌體去除率的影響見圖1。

反應(yīng)溫度是影響酶活的重要因素[7]，根據(jù)溶菌酶的產(chǎn)品說明，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定擬考察的酶解溫度范圍是30～50 ℃，其他反應(yīng)條件為pH 6.0、加酶量2 %、攪拌速率500 r/min。

圖1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在反應(yīng)初期(反應(yīng)時(shí)間<2 h)，菌體去除率增長較快，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，菌體去除率的增長開始變的緩慢，最后趨于平穩(wěn)。此外，在考察的30～50 ℃范圍內(nèi)，菌體去除率隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，并在40 ℃時(shí)獲得最大值(65.2 %)。酶都存在一個最適的催化溫度和一個能夠維持其活性的溫度范圍，當(dāng)溫度超過此范圍時(shí)，酶的空間立體結(jié)構(gòu)就會發(fā)生變化，導(dǎo)致活性喪失。根據(jù)圖1所示的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)確定40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 溶液pH值對菌體去除率的影響

圖2 溶液pH值對菌體去除效果的影響Fig.2 Effect of solution pH on the bacteria removal rate

反應(yīng)體系的pH值也是影響酶活的重要因素[8]，因此本實(shí)驗(yàn)考察了溶液pH值(pH 5.5～8.0)對菌體去除率的影響，其他反應(yīng)條件為：40 ℃、加酶量2 %、攪拌速率500 r/min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，在所考察的溶液pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，菌體去除率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，并在pH 6.5時(shí)獲得最大值(81.9 %)。另外，菌體去除率隨時(shí)間的變化規(guī)律與圖1基本相同，即在反應(yīng)初期(反應(yīng)2 h內(nèi))，菌體去除率增長較快，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，去除率增長趨緩，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過4 h后趨于平穩(wěn)。因此確定適宜的反應(yīng)體系pH值為6.5。

2.3 加酶量對菌體脫除率的影響

圖3 溶菌酶用量對菌體去除率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the bacteria removal rate

為了降低酶解過程的成本，本實(shí)驗(yàn)考察了溶菌酶用量對菌體去除率的影響，其他反應(yīng)條件為：40 ℃、pH 6.5、攪拌速率500 r/min，結(jié)果如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在反應(yīng)初期(反應(yīng)時(shí)間<2 h)，隨著溶菌酶用量的增加，菌體去除率逐漸升高；但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過2 h后，即使溶菌酶用量從1 %增加至6 %，菌體去除率卻無明顯變化。因此，從降低生產(chǎn)成本的角度考慮，確定1 %的溶菌酶用量為最佳反應(yīng)條件。

2.4 攪拌速率對菌體去除率的影響

圖4 攪拌速率對菌體去除率的影響Fig.4 Effect of stirring speed on the bacteria removal rate

考慮到威蘭膠溶液的高粘度會影響酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)過程，而攪拌不僅能夠改善反應(yīng)體系的傳質(zhì)效果，同時(shí)還能降低威蘭膠溶液的粘度(即威蘭膠的剪切稀釋性能)。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了攪拌速率(400～800 r/min)對菌體去除率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，在反應(yīng)初期(反應(yīng)時(shí)間<2 h)，菌體去除率基本上隨著攪拌速率的增加而升高；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過2 h后，菌體去除率增勢減緩，最后趨于穩(wěn)定，且菌體去除率在攪拌速率為600 r/min時(shí)獲得最大值(86.2 %)。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)初期，攪拌速率的增加使得威蘭膠溶液的粘度逐漸降低，這有利于反應(yīng)體系的傳質(zhì)過程，增加了溶菌酶與菌體的接觸機(jī)會。此外，威蘭膠溶液的剪切稀釋性能只在一定的攪拌速率范圍內(nèi)最為顯著，當(dāng)攪拌速率超過一定數(shù)值后，效果則變得不明顯。因此，確定攪拌速率為600 r/min為最佳反應(yīng)條件。

2.5 威蘭膠醇析工藝對菌體的去除效果

乙醇沉淀法(即醇析法)是提取威蘭膠的常用工藝，該工藝涉及有機(jī)溶劑的使用和烘干等，這些操作均能夠?qū)w的破碎起到一定的效果。因此，本文采用乙醇沉淀法，以未經(jīng)酶解處理和經(jīng)過酶解處理的威蘭膠發(fā)酵液為原料，對威蘭膠進(jìn)行了提取，并測定了各樣品中的菌體含量。結(jié)果表明，從未經(jīng)酶解處理的發(fā)酵液提取的威蘭膠樣品中，殘留有60.3 %的菌體，而從經(jīng)過酶解處理的發(fā)酵液提取的威蘭膠樣品中僅剩余6.4 %的菌體。這說明利用溶菌酶對威蘭膠發(fā)酵液進(jìn)行脫除菌體的操作，大幅度降低了威蘭膠產(chǎn)品中菌體的含量，提高了威蘭膠的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本文以溶菌酶為催化劑，對鞘氨醇單孢桿菌(Sphingomonassp.WG)生產(chǎn)的威蘭膠發(fā)酵液進(jìn)行了脫除菌體的酶解工藝研究，考察了反應(yīng)溫度、pH值、酶用量和攪拌速率對菌體去除率的影響，獲得最佳酶解工藝為40 ℃，pH 6.5，溶菌酶加入量1.0 %，攪拌速率600 r/min。在此條件下，威蘭膠發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的去除率為89.2 %。該發(fā)酵液經(jīng)醇沉工藝提取后，威蘭膠產(chǎn)品中菌體去除率為93.6 %，與未經(jīng)酶解工藝處理的威蘭膠產(chǎn)品相比，菌體含量降低了53.9 %。