解毒化瘀顆粒對肝衰竭大鼠的作用機制
——肝損傷和肝線粒體自噬蛋白Mfn1、Mfn2的影響

呂建林,毛德文,張文富,陳月橋,張榮臻,潘哲,王海燕

(1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023； 2.深圳市寶安中醫(yī)院(集團), 廣東深圳518133)

肝衰竭(liver failure，LF)是臨床常見的多種因素形成的肝功能嚴重障礙性，可以迅速發(fā)展為多器官衰竭的疾病，具有極高病死率[1]。LF發(fā)病原理存在不確定性，當前還缺乏對應結(jié)論。外泌體起源于細胞內(nèi)吞中質(zhì)膜的內(nèi)化過程，由多囊泡體(MVB)向內(nèi)萌芽形成，并在MVB與質(zhì)膜(PM)融合后從細胞釋放到微環(huán)境中的一種納米級的EVs[2-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞再生過程依賴于線粒體的調(diào)控，因此，線粒體合成在肝細胞再生進程中占據(jù)重要地位[4]。而近期國外研究結(jié)果表明，細胞自噬的調(diào)節(jié)水平也是細胞再生依托的重要途徑[5]，線粒體選擇性自噬途徑降解缺損線粒體是肝細胞存活和再生的關鍵機制。

本研究運用的解毒化瘀顆粒全方具清熱解毒、活血化瘀之功的臨床經(jīng)驗方。本課題前期臨床研究證明，解毒化瘀顆粒對肝細胞線粒體的保護作用；并通過調(diào)節(jié)氧化還原體系保護肝細胞線粒體，抑制肝細胞壞死與凋亡；本方并能通過負向調(diào)節(jié)作用，減少血清TNF-α、LPS升高而導致的肝細胞損傷[6-7]。在前期研究的基礎上，本實驗主要觀察解毒化瘀顆粒治療對肝衰竭大鼠肝損傷及線粒體自噬特異性蛋白Mfn1、Mfn2表達的影響。

1 材料

1.1 動物

實驗用的180只SPF級Wistar大鼠，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重(200±20)g，動物合格證號(SCXK[湘]2018- 0002)。實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，批件號(2018-KY-NSFC-152)，于廣西中醫(yī)藥大學SPF動物實驗室中飼養(yǎng)，實驗室內(nèi)室溫和濕度適中，室內(nèi)光線和通風良好，大鼠可自由飲食和攝取。

1.2 試驗藥物

解毒化瘀顆粒由茵陳30 g、白花蛇舌草30 g、赤芍50 g、大黃15 g、郁金15 g、石菖蒲15 g組成，使用中藥配方顆粒劑，所有藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學羅耽副教授鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》規(guī)范，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院購進，江陰天江藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒，按比例配制，給藥劑量參照前期研究配制成0.22 g/mL的藥液濃度，并收集在干凈玻璃瓶中[7]，使用前 37 ℃水浴加熱。

1.3 試劑及儀器

D-氨基半乳糖(D-GalN)、脂多糖( LPS)均由美國Sigma公司提供。Mfn2 Antibody、Mfn1 Antibody，Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液均由美國CST公司提供。

1.4 實驗儀器

恒溫振蕩器SHZ-82A型產(chǎn)自蘇州國華企業(yè)；臺式離心機TG16G型產(chǎn)自上海醫(yī)用分析儀器廠；TS100 型熒光倒置相差顯微鏡購于日本 Nikon 公司；DYCZ-24DH 型電泳儀和DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀于購自于北京六一生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

180只SPF級Wistar大鼠隨機分為正常組40只、模型組和解毒化瘀顆粒給藥組(JDHYKL組)各70只，造模成功后24 h每組隨機選取8只存活大鼠收集標本進行相關標本檢測。各組剩余大鼠做存活率觀察。

2.2 急性肝衰竭動物模型制備

為保證造模后各組大鼠血清LPS水平的齊同，采用D-GalN + LPS聯(lián)合制備急性肝衰竭大鼠模型(按D-GalN 800 mg/kg和LPS 0.1 mg/kg的劑量，腹腔注射一次成模)[7]。

2.3 給藥方法

鑒于動物模型的時效性，于建模前5天，開始進行灌胃(ig)用藥，維持到建模結(jié)束后24 h，日均2次，單次間隔12 h，灌胃液體量為每天2 mL/100 g，正常組跟模型組分別給予等量蒸餾水代替。

2.4 取材與標本處理

①肝組織病理變化觀察：成模后3 d，脊椎脫臼法處死大鼠，提出肝大葉組織，將其置于10 %甲醛溶液內(nèi)，且脫水，以石蠟進行填埋，取片，HE染色，生成切片，從顯微鏡中開展病理學研究。

②肝功指標測定：血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)以及總膽紅素(TBIL)的情況。③Western Blot檢測肝組織Mfn1、Mfn2的表達。

2.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，對比前開展正態(tài)分布評估，結(jié)合方差齊性驗證，達到齊性要求則實施單因素方差研究，若滿足統(tǒng)計學要求，利用SNK實施進階對比，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 研究結(jié)果

3.1 兩組大鼠肝臟組織病理情況

HE染色顯示正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)完整。而在模型組中的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)纖維增生情況，并伴有大量炎性細胞浸潤，形成假小葉，肝細胞壞死，空泡化，肝竇擴張充血。JDHYKL組肝組織中肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細胞呈直線排列，并形成一些假小葉。與模型組比較，肝細胞壞死、空泡減少。見圖1。

(a) 正常組 (b) 模型組 (c) JDHYKL組

3.2 各組大鼠肝功能檢測情況

血生化檢測結(jié)果顯示，模型組AST水平與正常組大鼠比較顯著增高(P<0.01)；JDHYKL組大鼠AST水平與模型組比較明顯下降(P<0.01)。模型組大鼠ALT水平較正常組顯著增高(P<0.01)；JDHYKL組大鼠ALT水平較模型組顯著降低(P<0.05)。模型組大鼠TBIL數(shù)據(jù)比正常組明顯提高(P<0.05)；JDHYKL組大鼠TBIL數(shù)據(jù)比模型組差異不符合統(tǒng)計學要求(P>0.05),具體見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平比較1Tab.1 Comparison of serum ALT, AST and TBIL levels of rats in each group

3.3 肝組織Mfn1、Mfn2蛋白的表達

提取肝組織蛋白后，Western Blot評估LF樣本組織線粒體外膜結(jié)合有關蛋白Mfn1、Mfn2的表達水平。與正常組相比，模型組Mfn1蛋白數(shù)據(jù)下降明顯(P<0.01)，跟模型組對比，JDHYKL干預后Mfn1蛋白表達水平顯著上升(P<0.01)。跟正常組比較，模型組蛋白Mfn2表達水平下降且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，與模型組對比，經(jīng)JDHYKL干預后，治療組Mfn2蛋白表達升高水平更為顯著(P<0.01)，具體見表2和圖2。

表2 肝組織Mfn1、Mfn2的相對表達情況Tab.2 Relative expression of Mfn1 and Mfn2 in liver tissue

圖2 肝組織Mfn1、Mfn2蛋白的表達電泳Fig.2 Expression electrophoresis of Mfn1 and Mfn2 proteins in liver tissue

4 討論

肝衰竭的病理生理機制復雜，當前認為線粒體屬于肝組織能量輸入的關鍵亞細胞結(jié)構(gòu)，在保持肝組織代謝均衡上起到關鍵功能。肝組織線粒體自噬過程中，降解病變線粒體，防止其受損狀態(tài)下持續(xù)放出ROS與控制凋亡誘導因子，從中實現(xiàn)肝組織穩(wěn)定[8-9]。而在線粒體自噬降解過程涉及線粒體分裂和融合，線粒體的分裂與融合是協(xié)同進行的，線粒體裂變環(huán)節(jié)的蛋白包含蛋白1 ( Drp1)和分裂蛋白1(Fis1)負責，線粒體融合主要通過定位于線粒體外膜的融合蛋白1、2(Mfn1、Mfn2)兩者負責。敲除Fis1或負性表達Drp1可減少線粒體自噬[10]，偏高的Fis1能夠引發(fā)自噬程序[11]。Mfn1跟Mfn2經(jīng)證明為Parkin的底物，基因敲除Mfn1或Mfn2將引起線粒體片段化的問題[12]，即線粒體損壞，從而促進自噬。

中醫(yī)藥在應對肝衰竭上存在一定的歷史，效果良好。中醫(yī)藥能從多靶點、多方面、多層次保護肝細胞。本研究運用的解毒化瘀顆粒，屬于毛德文教授參考“毒邪病因”原理打造的臨床驗方，存在散熱解毒等積極作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明茵陳水提物能有效抑制NK-KB激活和抑制線粒體膜電位變化，從而達到抑制膽紅素誘導的細胞凋亡[13]。赤芍可以抑制ROS生成和穩(wěn)定線粒體膜電位，而降低細胞脂質(zhì)過氧化水平，提高抗氧化酶活力，起到保護細胞的作用[14]。大黃素型蒽醌類化合物包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素等物質(zhì)，可以誘導的Mfn2的表達[15]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)解毒化瘀顆粒治療后大鼠肝組織肝細胞形態(tài)組織結(jié)構(gòu)基本正常，細胞呈條索狀排列，部分假小葉形成，肝細胞壞死及空泡化較模型組減輕，并且能夠有效控制LF大鼠 ALT、AST，證實藥物能夠緩解肝臟損害。在FL模型組蛋白表達中，Mfn1和Mfn2的表達水平減少，這表明線粒體結(jié)合受到阻礙，致使裂變、損壞較多，而經(jīng)藥物干預后，Mfn1和Mfn2的表達水平均有一定程度提升。證實藥物能夠在一定程度上增強Mfn1和Mfn2的表達。

綜上所述，解毒化瘀顆粒可能是通過上調(diào)Mfn1和Mfn2的表達抑制線粒體分裂，推動線粒體結(jié)合，降低其碎片化程度，保護線粒體，而對大鼠肝衰竭發(fā)揮保護作用。