ISSR標記技術(shù)輔助形態(tài)學的紅曲菌株分類鑒定

朱麗萍，陳福生，楊 強，陳申習，邵彥春*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢430070；2.勁牌有限公司勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶435100）

紅曲菌（Monascusspp.）又稱為紅曲霉，是我國重要的藥食同源微生物。其發(fā)酵產(chǎn)品——紅曲在我國有近兩千年的應(yīng)用歷史[1]。在分類地位上，將紅曲菌歸屬于散囊菌目（Eurotiales）、曲霉科（Aspergillaceae）、紅曲霉屬（Monascus）[2]。目前，關(guān)于紅曲菌種的分類，一直存在著爭議，文獻報道的紅曲菌有30余種：1983年，HAWSKWORTH D L等[3]將紅曲菌歸分為3類；1987年，BARNARD E L等[4]研究發(fā)現(xiàn)，弗羅里達紅曲菌（Monascus floridanus）新種；1995年，CANNON P F等[5]發(fā)現(xiàn)2個新種：依據(jù)有性世代形態(tài)將其命名為蒼白紅曲菌（Monascus pallens）和血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）；2007年，李鐘慶等[6]利用形態(tài)學方法對紅曲菌屬進行分類后重新確認為8個種；2017年，BARBOSA R N等[7]將紅曲菌種分為兩組共9種，第一組為弗羅里達（Floridani）組，包括黃色紅曲菌（Monascus flavipigmentosum）、蜂蜜紅曲菌（Monascus mellicola）、累西腓紅曲菌（Monascus recifensis）、弗羅里達紅曲菌（Monascusfloridanus）、蒼白紅曲菌（Monascus pallens）、新月紅曲菌（Monascus lunisporas）和阿根廷紅曲菌（Monascus argentinensis）7個種；第二組為紅色（Rubri）組，包括紅色紅曲菌（Monascus ruber）和紫色紅曲菌（Monascus purpureus）2個種，并認為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）與紅色紅曲菌（Monascus ruber）為同一物種，血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）為同一物種；2018年，何亞濤[8]將紅曲菌分為兩個組共10種，第一組為弗羅里達（Floridani）組，與BARBOSA R N等[7]報道一致；第二組為紅色（Rubri）組包括紅色紅曲菌（Monascus ruber）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）和血紅紅曲菌（Monascussanguineus）3個種，其中認為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）為一個獨立的種。表明紅曲菌物種具有豐富的多樣性，有必要借助有效的分類方法進行區(qū)分。

目前，紅曲菌的分類鑒定方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學方法和現(xiàn)代的分子生物學方法[9]。依據(jù)形態(tài)特征進行分類的方法是紅曲菌分類鑒定的主要手段[10]，但由于受環(huán)境、人的主觀判斷的影響較大，往往不能有效區(qū)分形態(tài)相近的種。而物種的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列信息通常不受外界環(huán)境的影響，因此，基于DNA序列信息的分子標記技術(shù)常被用來輔助形態(tài)學分類[11]。分子生物學方法共同的特點是以DNA為材料，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果或DNA測序結(jié)果進行聚類分析，但由于各種分子生物學技術(shù)的原理不同，并且PCR擴增結(jié)果受擴增體系內(nèi)組分、擴增條件等因素的影響較大，不同分子生物學分類方法可能會出現(xiàn)聚類結(jié)果不一致的情況。通過比較分析不同的分子標記技術(shù)，內(nèi)部簡單重復(fù)序列（inter simple sequence repeats，ISSR）技術(shù)被篩選出來作為輔助紅曲菌形態(tài)學分類的有效方法[12-13]。

ISSR標記技術(shù)是利用真核生物基因組中廣泛存在的簡單重復(fù)序列（simple sequence repea，SSR），設(shè)計出能與其結(jié)合的各種PCR引物，對兩個相距較近且方向相反的SSR序列之間的DNA區(qū)段進行擴增，并檢測其多態(tài)性[14]。ISSR技術(shù)所用的PCR引物長度在20個核苷酸左右，可以采用與常規(guī)PCR相同的反應(yīng)條件，具有操作簡單、可重復(fù)性高、模板DNA用量少等優(yōu)點[15-16]，且ISSR指紋分析可以作為區(qū)分具有相似形態(tài)或ITS序列的絲狀真菌[17]，以及分析檢測種的復(fù)雜度和驗證新種的有效工具。因此，本研究利用形態(tài)學分類鑒定法結(jié)合ISSR分子生物學分類鑒定法鑒別25種不同來源的紅曲菌，以期為不確定歸屬種的紅曲菌株分類鑒定提供一種輔助鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

25株實驗用菌株為MY1、MY2、MY3、ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH5、JC1、JC2、MG1、MG2、MG3、MF2、MF3、MS1、MS3、GW1、GW2、GW3、GW4、GW5、GW6、GW7、MS2，其中，前17株菌株分離自不同類型的紅曲產(chǎn)品，菌株MS1前期已被鑒定為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，對應(yīng)的編號為CCTCC M 2013295，其余16株保藏于華中農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院食品安全與技術(shù)實驗室；菌株GW1～GW7購自荷蘭菌種保藏中心，對應(yīng)的編號分別為紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 554.76、高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）CBS 302.78、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）CBS 736.83、血紅紅曲菌（Monascussanguineus）CBS 123568、紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 254.65、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）CBS 290.34和紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 291.34）；菌株MS2購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，對應(yīng)的編號為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）AS 3.5838。

1.1.2 試劑

EasyTaqDNA聚合酶、Trans 2K plus Marker、Trans 15K Marker：北京全式金生物有限公司；RNase A：寶生物技術(shù)（北京）有限公司；麥芽汁浸粉、瓊脂（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基[18]

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g土豆去皮后切成小塊，加水煮沸20 min，過濾后，加入20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，以蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然。

麥芽提取物瓊脂（malt extract agar，MEA）培養(yǎng)基：麥芽提取粉20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

麥芽汁瓊脂（wort agar，WA）培養(yǎng)基：麥芽汁（15°Bx）1 000 mL，瓊脂15 g。

察氏酵母提取粉瓊脂（Czapek yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，酵母提取物5.0 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然。

25%甘油硝酸鹽瓊脂（25%glycerol nitrate agar，G25N）培養(yǎng)基：在CYA培養(yǎng)基中加入25%甘油。

PDA培養(yǎng)基在115 ℃滅菌20 min。MEA、WA、CYA、G25N培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

T960型PCR儀：上海Heal Force公司；DYY-8C凝膠成像系統(tǒng)：北京六一電泳儀器廠；Neofuge 18R高速冷凍離心機：上海Heal Force公司；SCB-1360無菌操作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HH-8水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌的形態(tài)學觀察

菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察：將在PDA上活化7 d后的25株菌株分別接種到MEA、WA、CYA、G25N培養(yǎng)基上，將平板倒置在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察第7天的菌落形態(tài)特征，主要記錄其菌落形態(tài)、生長速度、氣生菌絲疏密和產(chǎn)色素等情況；同時，取無菌蓋玻片，以傾斜約45°方式插入WA培養(yǎng)基中，每皿插入4～6片，25 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)7 d，取蓋玻片在顯微鏡下觀察包括菌絲顏色及形態(tài)、分生孢子形態(tài)、閉囊殼和子囊孢子形態(tài)在內(nèi)的顯微形態(tài)特征，記錄并拍照。

1.3.2 紅曲菌ISSR的聚類分析

紅曲菌基因組提?。壕唧w提取步驟參照SHAO Y C等[19]的方法。

ISSR聚類分析：以25株供試紅曲菌的DNA為模板，采用前期篩選的包括808#、810#、811#、834#、835#、841#、842#在內(nèi)的7條引物進行ISSR實驗，引物序列見表1[20]，根據(jù)擴增片段的多態(tài)性對供試菌株進行聚類分析。

表1 ISSR分析所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in ISSR analysis

ISSR PCR擴增體系：模板1 μL，引物1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL，10×buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL，Mg2+（50 mmol/L）0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）17.7 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR擴增結(jié)束后采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

DNA多樣性聚類分析：對照25株菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖，根據(jù)同一位點DNA條帶的有無編成1、0矩陣輸入計算機，用NTSYSpc軟件中的SIMQUAI程序計算菌株間的相似系數(shù)，最后采用UPGMA法進行聚類分析，構(gòu)建相似聚類樹狀圖。相似系數(shù)的數(shù)值范圍為0～1，當數(shù)值接近于0時，表示兩菌株間遺傳相似性程度較低；當數(shù)值接近于1時，表示兩菌株間遺傳相似性程度較高。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試紅曲菌形態(tài)學分類鑒定

2.1.1 供試紅曲菌的菌落形態(tài)觀察結(jié)果

參照《紅曲菌的形態(tài)與分類學》[18]，根據(jù)菌落形態(tài)分類描述，可將本研究的25株供試菌株分為6類，具體菌落形態(tài)描述見表2，其中6種典型紅曲菌的菌落形態(tài)見圖1。

表2 25株供試紅曲菌的菌落形態(tài)觀察結(jié)果Table 2 Results of colony morphology of 25 tested strains

圖1 6種典型菌株的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of 6 typical strains

由表2及圖1可知，第一類為與叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1的菌落形態(tài)較為相似的菌株，包括菌株MS1、ZH3、GW6、MY1；第二類為與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）GW3的菌落形態(tài)較為相似的菌株，包括菌株MG1、MG2、MG3、ZH4、ZH5、MF2、JC2、MS2、GW3；第三類為與紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1的菌落形態(tài)較為相似的菌株，包括菌株MY2、MY3、MS3、JC1、GW1、GW5、GW7；第四類為與高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）GW2的菌落形態(tài)較為相似的菌株，包括菌株MF3和GW2；第五類為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）菌株GW4；菌株ZH1和ZH2菌落形態(tài)相近，但與其他菌株菌落形態(tài)均不相同，為第六類，需進一步分析鑒定。

2.1.2 紅曲菌顯微形態(tài)觀察結(jié)果

參照《紅曲菌的形態(tài)與分類學》[18]，根據(jù)WA培養(yǎng)基上顯微形態(tài)觀察結(jié)果，將25株供試菌株歸為7類，具體顯微形態(tài)觀察結(jié)果描述見表3，其中5種典型菌株的顯微形態(tài)見圖2。

由表3及圖2可知，第一類為與叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1的顯微形態(tài)較為相似的菌株，該類的分類結(jié)果與菌落形態(tài)分類結(jié)果相同；第二類為與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）GW3的顯微形態(tài)較為相似的菌株，該類的分類結(jié)果與菌落形態(tài)分類結(jié)果減少了菌株MS2，同時增加了菌株ZH1和ZH2；第三類為與紅色紅曲菌（Monascusruber）GW1的菌落形態(tài)較為相似的菌株，該類的分類結(jié)果與菌落形態(tài)分類結(jié)果減少了菌株GW7；第四類為與高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）GW2的菌落形態(tài)較為相似的菌株，該類的分類結(jié)果與菌落形態(tài)分類結(jié)果相同；第五類為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）菌株GW4，該類的分類結(jié)果與菌落形態(tài)分類結(jié)果相同；而菌株GW7和MS2的顯微形態(tài)中，分生孢子和菌絲形態(tài)不同，但均未觀察到其閉囊殼，可能由于這兩株菌株在WA培養(yǎng)基下很少產(chǎn)生或不產(chǎn)生閉囊殼，或其閉囊殼形成時間發(fā)生改變而未被觀察到。菌株GW7和MS2分別分類為第六類和第七類。

表3 25株供試紅曲菌顯微形態(tài)觀察結(jié)果Table 3 Results of microscopic morphology of 25 tested strains

圖2 5種典型菌株的顯微形態(tài)Fig. 2 Microscopic morphology of 5 typical strains

2.1.3 供試菌株的形態(tài)學鑒定結(jié)果

綜合形態(tài)觀察結(jié)果，根據(jù)《紅曲菌的形態(tài)與分類學》[18]，對25種供試菌株進行初步分類鑒定，結(jié)果見表4。

表4 25株供試菌株的形態(tài)學分類結(jié)果Table 4 Results of morphological classification of 25 tested strains

由表4可知，25株供試菌株歸為6類，分別為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）、高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）、血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）和待定。其中菌株ZH1和ZH2菌落形態(tài)相近，而與其他菌種菌落形態(tài)顯著不同，僅見顯微形態(tài)與紫色紅曲菌的顯微形態(tài)相近，仍需進一步分析鑒定。菌株GW7和MS2的菌落形態(tài)分別與紅色紅曲菌和紫色紅曲菌相近，但顯微形態(tài)中未觀察到閉囊殼，有必要進一步分析鑒定。

2.2 供試紅曲菌ISSR分類結(jié)果

2.2.1 ISSR PCR擴增結(jié)果

25株供試紅曲菌的ISSR PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，PCR擴增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表5。

由圖3及表5可知，每條引物可以擴增出7～16條DNA條帶，7條引物共擴增出88條DNA條帶，其中90.1%呈多態(tài)性，除血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）GW4的ISSR擴增圖譜與其他菌株的圖譜差異較大，其余菌株均擴增出l～2條大小相同的條帶，這一方面表明了紅曲菌屬內(nèi)種群之間遺傳背景的多樣性，另一方面也反映出它們同屬間的共性。

表5 ISSR PCR擴增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條數(shù)Table 5 Total stripes and polymorphic stripes of PCR amplified products of ISSR

2.2.2 ISSR PCR擴增結(jié)果聚類分析

將每株紅曲菌用7條引物PCR擴增得到的所有條帶進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖4。

圖4 基于ISSR 25株供試菌株聚類分析結(jié)果Fig. 4 Results of clustering analysis of 25 tested strains based on ISSR fingerprints

由圖4可知，供試紅曲菌菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.39～1.00，表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。在相似性水平為0.9時，25株菌株可分為5類，第一類包括菌株ZH3、MY2、MS3、MS1、GW6、MY3、JC1、MY1、GW1、GW5在內(nèi)的共10株菌株，這些菌株的遺傳相似系數(shù)＞0.91；第二類只有菌株GW7；第三類只有菌株GW4；第四類包括菌株MG3、ZH5、ZH1在內(nèi)的共3株菌株，這些菌株的遺傳相似系數(shù)＞0.93；第五類包括菌株JC2、MG1、MF3、GW2、ZH4、MS2、MG2、GW3、MF2、ZH2在內(nèi)的共10株菌株，這些菌株的遺傳相似系數(shù)＞0.93。

2.3 形態(tài)學分類結(jié)果與ISSR聚類結(jié)果比較分析

根據(jù)菌落形態(tài)，菌株GW7與紅色紅曲菌（Monascus ruber）相似，菌株MS2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相似，但根據(jù)顯微形態(tài)，菌株GW7與MS2中均未觀察到閉囊殼。根據(jù)菌落形態(tài)，菌株ZH1、ZH2與其他菌株均不相同，而根據(jù)顯微形態(tài)，菌株ZH1、ZH2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相似。為進一步分析這些菌株的分類關(guān)系，采用ISSR進行輔助分類分析。ISSR聚類分析結(jié)果顯示，菌株GW7與紅色紅曲菌（Monascus ruber）遺傳相似系數(shù)達到0.80，故將其鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）；菌株MS2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）遺傳相似系數(shù)達到1.00，則將其鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）；菌株ZH1和ZH2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）遺傳相似系數(shù)分別為0.88和0.96，則將其均鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

根據(jù)形態(tài)學分類方法，菌株MG3、ZH5的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，均與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相近，且根據(jù)聚類分析結(jié)果，菌株MG3、ZH5與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的遺傳相似系數(shù)＞0.88，所以將其均鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

根據(jù)形態(tài)學分類方法，將菌株MF3、GW2歸為高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）；而ISSR分子生物學分類結(jié)果顯示，菌株MF3、GW2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的遺傳相似系數(shù)＞0.98，故將菌株MF3、GW2鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。此結(jié)果與李鐘慶等[6]報道的高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）是紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的同種異名結(jié)果一致。

根據(jù)形態(tài)學分類方法，將菌株ZH3、GW6、MY1、MS1鑒定為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）；菌株MY2、GW7、MY3、JC1、MS3、GW1、GW5鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber），而叢毛紅曲菌（Monascuspilosus）MS1和紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1兩株標準菌株在MEA和WA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)無明顯差異，且ISSR分子生物學分類結(jié)果顯示，菌株ZH3、MY3、MY2、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）GW6、MS3、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1、MY1、JC1、GW5、紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1的遺傳相似系數(shù)＞0.91，故將菌 株ZH3、GW6、MY1、MS1、MY2、GW7、MY3、JC1、MS3、GW1、GW5綜合鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）。這與BARBOSA R N等[7]認為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）與紅色紅曲菌（Monascus ruber）為同一類的報道相符。

綜合形態(tài)學分類方法與ISSR分子鑒定的方法可知，目前市售紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)菌種主要為紅色紅曲菌（Monascus ruber）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus），與文獻[21]報道的一致。但由于生產(chǎn)條件或菌株自身的遺傳差異，導致一些菌株分類鑒定存在不確定性。本研究表明，以形態(tài)學分類方法為基礎(chǔ)，以ISSR分子鑒定的方法為輔助，可以分析檢測紅曲菌種的復(fù)雜度以及相似性關(guān)系。研究結(jié)果也為了解市售紅曲相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)菌株的特征和應(yīng)用情況，進一步發(fā)掘和保護紅曲菌株資源提供參考。

3 結(jié)論

本研究以市場購買的紅曲產(chǎn)品分離得到的17株紅曲菌和8株標準菌株為主要材料，根據(jù)其在MEA、WA、CYA、G25N四種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和WA培養(yǎng)基上的顯微形態(tài)特征，將25株紅曲菌分為6大類，ISSR分子生物學分類鑒定法將25株紅曲菌分為5大類。綜合形態(tài)學與ISSR分子標記鑒定結(jié)果，25株紅曲菌株可以聚為3大類，將菌株ZH3、MY2、MS3、MS1、GW6、MY3、JC1、MY1、GW1、GW5、GW7鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）；將菌株MG3、ZH5、ZH1、JC2、MG1、MF3、GW2、ZH4、MS2、MG2、GW3、MF2、ZH2鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）；菌株MG4鑒定為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）。