常壓室溫等離子誘變與微生物微滴培養(yǎng)選育幾丁質(zhì)脫乙酰基酶高產(chǎn)菌株

馬欽元，申雁冰，丁盼盼，屠琳娜，畢心宇，王 敏*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.洛陽華清天木生物科技有限公司，河南 洛陽471023）

幾丁質(zhì)是自然界中僅次于纖維素的第二大生物聚合物，主要存在于無脊椎動(dòng)物，如蝦、蟹、昆蟲、海藻以及真菌及酵母細(xì)胞壁中[1-2]。盡管幾丁質(zhì)含量豐富，但由于其不溶解特性導(dǎo)致商業(yè)應(yīng)用價(jià)值較低。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫掉乙?；漠a(chǎn)物，因其可溶于稀酸，商業(yè)應(yīng)用價(jià)值較幾丁質(zhì)有大幅度提升，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、水處理等領(lǐng)域[3-4]。目前殼聚糖主要采用傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)，存在環(huán)境污染嚴(yán)重、工藝難控制、產(chǎn)品質(zhì)量特別是脫乙酰度不穩(wěn)定等問題[5-7]。采用幾丁質(zhì)脫乙?；福╟hitin deacetylase，CDA）酶法脫乙酰制備殼聚糖，因其反應(yīng)過程易于控制、產(chǎn)品脫乙酰度穩(wěn)定、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，成為殼聚糖生產(chǎn)的替代選擇，并越來越受到人們的重視。然而，由于CDA產(chǎn)率低、底物不溶解等問題[8]，目前該工藝還無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[9]，所以高產(chǎn)CDA的菌株篩選仍然是解決CDA應(yīng)用的主要途徑之一。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)是一種高效的微生物育種技術(shù)[10-11]。微生物微滴培養(yǎng)（microbial microdroplet-culture，MMC）技術(shù)是基于液滴微流控技術(shù)最新研發(fā)而成的一款微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，是一種基于微流控技術(shù)的微型化、自動(dòng)化、智能化的高通量微生物培養(yǎng)，具有高通量、自動(dòng)傳代、化學(xué)因子梯度添加、在線檢測(cè)液滴光譜、微生物分選等功能[12]。ARTP目前已經(jīng)高效應(yīng)用于多種細(xì)菌、真菌以及植物種子等的誘變選育[13-19]，但鮮有將ARTP應(yīng)用于CDA發(fā)酵菌株的誘變選育，同時(shí)MMC也是首次被應(yīng)用于CDA高產(chǎn)菌株的高通量篩選。

為了獲得高效獲得CDA的高產(chǎn)菌株，該研究以可分泌作用大分子底物CDA的馬紅球菌（Rhodococcus equiCGMCC14861）為出發(fā)菌株[20]，首先進(jìn)行室溫等離子（ARTP）誘變，并通過微滴培養(yǎng)（MMC）技術(shù)進(jìn)行了誘變高產(chǎn)菌株的高通量液滴篩選，隨后將篩選到的液滴進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋平板篩選和24深孔板復(fù)篩，并通過對(duì)比分析單位菌體產(chǎn)CDA的能力確定最佳誘變高產(chǎn)菌株。該研究提供了一種新的CDA高通量篩選方法，為CDA高產(chǎn)菌株的誘變選育以及其他可通過顯色反應(yīng)進(jìn)行菌株篩選的工作提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬紅球菌（Rhodococcus equi）：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院分離、鑒定，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）（保藏號(hào)：CGMCC14861）。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）：天津時(shí)北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；4-硝基乙酰苯胺（分析純）：上海廣銳生物科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH6.0～7.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g/L。

篩選培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入50 mg/L的4-硝基乙酰苯胺。

上述培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ⅡS型ARTP誘變育種儀：江蘇無錫源清天木生物科技有限公司；MMC-1全自動(dòng)高通量微生物微滴培養(yǎng)儀：洛陽華清天木生物科技有限公司；ELX808全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；ZHWY-211F 往復(fù)式大容量恒溫?fù)u床：上海智誠分析儀器制造有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；ZXSD-B1160電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；GI54D立式壓力蒸汽滅菌鍋：美國Zealway公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株種子液及發(fā)酵液的制備

種子及發(fā)酵培養(yǎng)液的制備：將分離純化得到的馬紅球菌（Rhodococcus equi）CGMCC14861轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。按照接種量為10%將種子液接種于裝液量為50 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。

1.3.2 CDA原始菌株的ARTP誘變[18-19]

取1 mL培養(yǎng)24 h的馬紅球菌（R.equi）CGMCC14861菌液于6 000 r/min離心3 min，棄上清液，生理鹽水洗滌2次，再將菌體重懸于1 mL生理鹽水制成菌懸液。調(diào)節(jié)均懸液OD600nm值在0.6～0.8，然后吸取10 μL涂在誘變鋅片（鋅片先用酒精燈燒熱，在超凈臺(tái)冷卻后用移液器涂片），然后進(jìn)行ARTP誘變，為確定最佳處理時(shí)間，分別設(shè)置菌懸液的誘變時(shí)間為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s，誘變完成后將鋅片放入裝有1 mL無菌水的EP管，稀釋10 000倍后進(jìn)行平板涂布，平板37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行致死率曲線的繪制。選取致死率70%～80%的誘變時(shí)間進(jìn)行4輪誘變。

1.3.3 誘變高產(chǎn)CDA菌株的篩選

設(shè)計(jì)了包括ARTP誘變、微滴培養(yǎng)（MMC）、LB平板初篩和24深孔板發(fā)酵復(fù)篩四部分內(nèi)容的高產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙?；妇甑恼T變選育方法，見圖1。以R.equiCGMCC14861為出發(fā)菌株首先進(jìn)行ARTP誘變，誘變后，將誘變后的菌懸液加入含有4-硝基乙酰苯胺（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行微滴培養(yǎng)（MMC）。單個(gè)微流控芯片包含0～200個(gè)液滴單元，其中每個(gè)液滴的體積約為2 μL，液體可以進(jìn)行350～800 nm的波長掃描，選擇400 nm作為篩選波長。篩選到吸光度值較對(duì)照組明顯升高的液滴，然后將液滴進(jìn)行稀釋后涂布于加入含有4-硝基乙酰苯胺（50 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，固體培養(yǎng)基中的4-硝基乙酰苯胺可以被菌體產(chǎn)生的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶脫乙酰生成黃色的4-硝基苯胺而產(chǎn)生黃色圈，黃色圈越大說明菌體的產(chǎn)酶能力越強(qiáng)，所以選擇黃色圈較大的菌落進(jìn)行24深孔板37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)4 h進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證。

圖1 常壓室溫等離子+微流控對(duì)高產(chǎn)ReCDA菌株的誘變選育流程Fig. 1 Process of mutagenesis and breeding of high-yield ReCDA strain by atmospheric and room temperature plasma and microbial microdroplet-culture

1.3.4 CDA酶活力檢測(cè)[20]

采用4-硝基乙酰苯胺脫乙酰生成對(duì)硝基苯胺產(chǎn)物的顏色變化在波長400 nm下發(fā)生明顯的吸光度值變化來表征酶活力。

（1）對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.005 g對(duì)硝基苯胺，加少量水溶解并在50 mL容量瓶中定容。然后用去離子水進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀釋，以去離子水為參照，測(cè)定波長400 nm處的吸光度值。以對(duì)硝基苯胺質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）反應(yīng)體系

稱取10 mg 4-硝基乙酰苯胺，用50 mL容量瓶定容，質(zhì)量濃度為200 mg/L。加200 mg/L的4-硝基乙酰苯胺0.3 mL，再加酶液0.3 mL（直接吸取發(fā)酵液），37 ℃預(yù)保溫的磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH=7）0.9 mL，在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，沸水浴終止酶活反應(yīng)。

（3）酶活檢測(cè)

終止反應(yīng)后的溶液經(jīng)10 000 r/min離心分離5 min，測(cè)定上清液波長400 nm處吸光度值，設(shè)置3個(gè)平行?？瞻讓?duì)照：加4-硝基乙酰苯胺溶液0.3 mL，加緩沖液0.9 mL，0.3 mL滅活酶液（沸水浴滅活）。

（4）CDA酶活力定義及酶活力計(jì)算

CDA酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每小時(shí)產(chǎn)生1微克對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

CDA酶活力計(jì)算公式如下：

式中：A400nm為酶解液樣品的吸光度值；A0為空白的吸光度值；D為稀釋倍數(shù)；T為酶促反應(yīng)時(shí)間，h；K為線性系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線

ARTP不同處理時(shí)間對(duì)R.equiCGMCC14861的生長及致死率影響，結(jié)果見圖2。由圖2a可知，ARTP照射處理10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s后，R.equiCGMCC14861的生長明顯受到抑制。由圖2b可知，ARTP照射處理10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s后，致死率分別為25.5%、62.8%、80.40%、96.87%、98.10%、99.14%、99.39%、99.88%。根據(jù)研究報(bào)道，選取致死率為70%～80%時(shí)，誘變效果最佳[20]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，誘變時(shí)間20s時(shí)致死率為62.8%、30 s時(shí)達(dá)到了80.40%，誘變時(shí)間25s的致死率可在70%～80%這個(gè)范圍，因此，本研究采用ARTP誘變時(shí)間為25 s。

圖2 常壓室溫等離子不同誘變時(shí)間對(duì)馬紅球菌CGMCC14861生長（a）及致死率（b）的影響Fig. 2 Effect of different atmospheric and room temperature plasma treatment times on the growth (a) and mortality rates (b) of Rhodococcus equi CGMCC14861

2.3 誘變高產(chǎn)菌株的MMC篩選

ARTP誘變后的菌液加入MMC培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行高產(chǎn)CDA液滴的篩選，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，經(jīng)過ARTP誘變后有多個(gè)液滴的OD400nm值數(shù)據(jù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長增加顯著。其中，有五個(gè)液滴的OD400nm值數(shù)據(jù)增幅最大，分別是液滴73、74、75、76和105，表明這5個(gè)液滴中CDA的活性較高。所以，推測(cè)這五個(gè)液滴中均存在高產(chǎn)CDA的誘變菌株。五個(gè)液滴中73、74、75、76四個(gè)液滴相鄰且均出現(xiàn)OD400nm值數(shù)據(jù)增幅較大的結(jié)果，說明在這個(gè)范圍的液滴中可能存在相同的高產(chǎn)CDA誘變菌株。

圖3 馬紅球菌CGMCC14861的微生物微滴培養(yǎng)結(jié)果Fig. 3 Results of microbial microdroplet-culture of Rhodococcus equi CGMCC14861

2.4 誘變高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

對(duì)獲得的五個(gè)OD400nm值數(shù)據(jù)增幅最大的液滴分別稀釋后進(jìn)行LB平板初篩及24深孔板復(fù)篩，平板初篩主要是通過固體培養(yǎng)基中的4-硝基乙酰苯胺可以被菌體產(chǎn)生的幾丁質(zhì)脫乙?；该撘阴Ｉ牲S色的4-硝基苯胺而產(chǎn)生黃色圈，黃色圈越大說明菌體的產(chǎn)酶能力越強(qiáng)，選擇黃色圈較大的菌落進(jìn)行24深孔板37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)4 h進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證，復(fù)篩的原理主要是模擬微量液體發(fā)酵，發(fā)酵4h后取樣檢測(cè)酶活確定高產(chǎn)CDA的菌株，結(jié)果見圖4。由圖4a可知，原始菌株R.equiCGMCC14861在24深孔板發(fā)酵4 h的OD400nm值為0.207，紅線以上為產(chǎn)酶增加的菌株，其中OD400nm值＞0.630的有17株（A41、B4、B5、B7、B14、B24、B39、C7、C26、C35、C41、C53、C59、C63）。即經(jīng)過多輪篩選最終從700多個(gè)平板單菌落中篩選出17株與原始菌株相比發(fā)酵產(chǎn)酶提高300%以上的誘變高產(chǎn)CDA菌株。由圖4b可知，表征誘變菌株CDA產(chǎn)量的OD400nm值與表征菌體生長的OD600nm值并不成正比，說明誘變菌株的CDA產(chǎn)量提升并不完全是由菌體量的增加導(dǎo)致。

圖4 幾丁質(zhì)脫乙?；父弋a(chǎn)菌株平板初篩（a）及24深孔板復(fù)篩（b）結(jié)果Fig. 4 Results of plate preliminary screening (a) and 24-deep-hole plate rescreening(b)of strains with high chitin deacetylase yield

篩選到的17株高產(chǎn)CDA菌株，其產(chǎn)酶及菌體生長變化結(jié)果見表1。由表1可知，OD600nm值最高的3個(gè)菌株分別是A41、C22和C39，產(chǎn)酶OD400nm值最高的三個(gè)菌株分別是B4、C7和C63，由此可見，誘變后菌株的CDA產(chǎn)量變化跟菌體生長并不成正比。為了更加準(zhǔn)確的表征誘變菌株的產(chǎn)CDA能力，對(duì)比分析了菌株OD400nm值/OD600nm值（OD400nm值/OD600nm值表示單位菌體的CDA產(chǎn)量），由表1可以看出，OD400nm值/OD600nm值數(shù)值最高的3個(gè)菌株分別是B4、C26和C41，即該3株菌株單位菌體產(chǎn)CDA最高（因?yàn)镺D400nm值是表征菌體產(chǎn)酶水平的，OD600nm值是表征菌體量的，兩個(gè)數(shù)據(jù)的比值可以表征單位菌體的產(chǎn)酶量），其中菌株B4 OD400nm值/OD600nm值最高，為出發(fā)菌株的3.15倍。

表1 幾丁質(zhì)脫乙?；妇甑漠a(chǎn)酶及菌體生長對(duì)比Table 1 Comparison of chitin deacetylase production and growth of strains

選取菌株B4進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)酶曲線見圖5。由圖5可知，發(fā)酵36 h誘變菌株B4達(dá)到最大產(chǎn)酶419.11 U/mL，是空白對(duì)照107.58 U/mL的3.90倍。經(jīng)過進(jìn)一步的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，確定最佳幾丁質(zhì)脫乙?；父弋a(chǎn)菌株為B4。

圖5 菌株B4搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶曲線Fig. 5 Chitin deacetylase production curve of strain B4 with shake flask culture method

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了基于常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)與微液滴流控篩選（MMC）技術(shù)的幾丁質(zhì)脫乙?；福–DA）高產(chǎn)菌株的誘變選育方法，誘變照射時(shí)間為25 s時(shí)致死率達(dá)到70%～80%，經(jīng)過多輪的誘變選育，最后獲得了17株產(chǎn)酶提高300%以上的CDA誘變高產(chǎn)菌株，通過對(duì)比分析17株高產(chǎn)菌株單位菌體產(chǎn)CDA的能力及發(fā)酵驗(yàn)證，獲得了1株單位菌體產(chǎn)酶提升3.15倍的CDA高產(chǎn)菌株B4，發(fā)酵產(chǎn)酶總量達(dá)到419.11 U/mL，為原始菌種的3.90倍。本研究為CDA高產(chǎn)菌株的誘變選育及高通量篩選提供了一種新的方法和借鑒。

采用的誘變選育和構(gòu)建的快速篩選方法對(duì)于篩選CDA高產(chǎn)菌株是有效和可行的。但該方法能夠得到有效應(yīng)用的前提是找到了CDA脫乙酰后發(fā)生顏色反應(yīng)的底物4-硝基乙酰苯胺，且該底物對(duì)于菌株的生長和發(fā)酵未發(fā)生明顯的抑制作用。該方法目前還不適用于無法直接通過發(fā)酵液的吸光值變化來表征菌株變化的情況。