一種新型產(chǎn)乙酸乙酯釀酒酵母菌株的構(gòu)建

任津瑩，馬艷蕊，劉 港，陳葉福，肖冬光

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

白酒在中國有著源遠(yuǎn)流長的歷史，深受人民群眾喜愛，經(jīng)久不衰[1]。它是以谷糧為制酒原料，酒曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成[2]，是世界著名六大蒸餾酒之一。酯類是白酒中的主要香氣成分，大多以乙酯形式存在，對白酒風(fēng)格的形成起關(guān)鍵作用。其中乙酸乙酯是清香型白酒的主體香氣成分，適量的乙酸乙酯可以使酒體豐滿、柔和，香氣協(xié)調(diào)，其含量的高低直接影響清香型白酒的品質(zhì)[3]。

在傳統(tǒng)清香型白酒的釀造過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要產(chǎn)乙醇，產(chǎn)生的乙酸乙酯很少。產(chǎn)香酵母是產(chǎn)乙酸乙酯的主要發(fā)酵微生物，但其產(chǎn)乙醇的能力較低[3-4]。為了獲得一定量的乙酸乙酯，通常會增加糧耗、延長發(fā)酵周期。長期采取這種方式效率低、成本高。為了改善這一狀況，構(gòu)建新型產(chǎn)乙酸乙酯釀酒酵母菌株，使其在發(fā)酵過程中保持優(yōu)良酒精發(fā)酵特性的同時(shí)生產(chǎn)基礎(chǔ)酯香物質(zhì)乙酸乙酯，對于白酒產(chǎn)品風(fēng)味特征的維持與強(qiáng)化，以及白酒質(zhì)量的提高與穩(wěn)定具有重要意義。酵母中產(chǎn)酯的途徑主要有兩條，一是通過自身含有的少量酯化酶催化酸和醇直接形成酯；另一條是通過醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）將?；o酶A中的?；D(zhuǎn)移到醇類底物形成酯，后者是酵母產(chǎn)酯的主要途徑[5]。相關(guān)研究表明，醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因ATF1、ATF2的表達(dá)水平對乙酸乙酯和乙酸異戊酯的合成影響很大[6-8]。LILLY M等[9]在工業(yè)菌株中過表達(dá)ATF1基因，以葡萄汁發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，最終葡萄酒中的乙酸乙酯濃度提高了20%～90%，乙酸異戊酯濃度提高了30%～110%。SAERENS S M等[10-11]證明了釀酒酵母中的醇酰基轉(zhuǎn)移酶EHT1、EEB1在發(fā)酵過程中主要負(fù)責(zé)中鏈脂肪酸乙酯的生物合成，同時(shí)對乙酸乙酯這類短鏈酯也有一定的催化活性。目前，國內(nèi)對釀酒酵母的研究中，大多是對內(nèi)源醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行過表達(dá)以提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，關(guān)于引入外源尤其是綠色植物來源的醇?；D(zhuǎn)移酶基因以達(dá)到大幅提高乙酸乙酯產(chǎn)量的研究較少。同時(shí)，綠色植物作為一個(gè)巨大且豐富的天然AAT庫，存在可開發(fā)用于提高釀酒酵母酯合成的潛力。

另一方面，白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的高級醇具有獨(dú)特的呈味特征，對酒的風(fēng)味形成發(fā)揮著不可替代的作用[12]。適量的高級醇不僅可以襯托出酯的香氣，賦予酒類特殊的香味，還可以使酒的口感更加柔和、醇厚，給人以圓潤、豐滿、協(xié)調(diào)的感覺[13]。但高級醇含量過高，會使白酒產(chǎn)生令人不愉快的異雜味[14]，一般白酒中高級醇含量要求＜0.2 g/100 mL（按60%vol計(jì)）[15]。此外，高級醇在人體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，停留時(shí)間較乙醇長，其對人體的毒害作用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙醇。在白酒工業(yè)生產(chǎn)中，一般通過改善工藝條件來控制高級醇的產(chǎn)量。孫金旭[16]研究表明，增加大曲用量和添加糖化酶可以降低高級醇的產(chǎn)量。羅惠波等[17]研究表明，適當(dāng)減少水用量、加糠量以及投糧量，均可以降低高級醇的產(chǎn)生。另外通過代謝工程提升高級醇的利用率，構(gòu)建新型高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇的釀酒酵母菌株，也是目前工業(yè)微生物育種的研究方向之一[14]。

本研究將來自綠色植物獼猴桃和草莓的醇?；D(zhuǎn)移酶基因AeAT9[18]、VAAT[19-20]分別引入釀酒酵母AY12-α，并通過強(qiáng)啟動子PGK1p對其進(jìn)行過表達(dá)。對獲得的重組菌株進(jìn)行白酒液態(tài)模擬發(fā)酵，分析兩基因?qū)︶劸平湍府a(chǎn)乙酸乙酯和高級醇的影響，為通過引入外源AAT提高釀酒酵母產(chǎn)酯能力的研究提供理論與實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉2 g/L。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉2 g/L。

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基[21]：酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、半乳糖20 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。

玉米水解液[22]：玉米粉碎顆粒和65～70 ℃的水按料液比1∶3（g∶mL）混合，放置20 min，使顆粒充分吸水膨脹；加入適量液化酶（α-淀粉酶）（2×104U/mL），在85～90 ℃水浴液化1.5 h，每隔一段時(shí)間攪拌一次；液化完成后降溫至60 ℃，加入適量糖化酶（1×105U/mL），在55～60 ℃水浴糖化20 h；待糖化液降溫后，用三層紗布過濾，得到澄清濾液即玉米水解液，pH自然，105 ℃滅菌20 min，備用。

一級發(fā)酵種子培養(yǎng)基[21]：調(diào)節(jié)玉米水解液的糖度為8°Bx，加入0.5%酵母浸粉，105 ℃滅菌20 min。

二級發(fā)酵種子培養(yǎng)基[21]：調(diào)節(jié)玉米水解液的糖度為12°Bx，加入0.5%酵母浸粉，105 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[21]：調(diào)節(jié)玉米水解液的糖度為18°Bx，添加MgSO4150 g/L、KH2PO475 g/L、尿素81 g/L，105 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖（生化試劑）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、尿素、氯化鈉（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；耐高溫糖化酶（2×104U/mL）、液化酶（1×105U/mL）、酸性蛋白酶（5×104U/mL）：丹麥Novozymes公司；PrimeSTAR Max高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、rTaq聚合酶（5 U/μL）、限制性核酸內(nèi)切酶XhoI（5 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；ClonExpressTMⅡ重組克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）：美國Amreco公司；遺傳霉素（G418）：美國Merck公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒：北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCT-200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀、DYY-4c電泳儀：美國BIO-RAD公司；Agilent 7890氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；Bioscreen全自動生長曲線測定儀：芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中GenBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的Gal80、AeAT9、VAAT基因的核苷酸序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中所需的PCR擴(kuò)增引物，見表2。所有引物均由金維智生物科技有限公司合成。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 2 Primers used in this study

（2）重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）的構(gòu)建

以Yep352-PGK作為基礎(chǔ)質(zhì)粒分別構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT），構(gòu)建流程見圖1。具體方法：在NCBI上分別找到獼猴桃和草莓的醇?；D(zhuǎn)移酶蛋白序列（AIC83789.1、CAC09062.1），并交由蘇州金唯智公司完成釀酒酵母的密碼子優(yōu)化和基因合成，優(yōu)化后的AeAT9基因序列如下：

GAAAACAACAGCAGCAACAAAATGGCAAGCTCT GTACGACTAGTGAAAAAGCCTGTCCTGGTCGCTCCCG TAGATCCCACACCGTCCACCGTCCTCTCTCTCTCCTCC CTCGACTCGCAGCTCTTCCTCCGCTTCCCCATCGAGT ACTTACTCGTCTACGCCTCACCCCACGGCGTAGACCG GGCCGTCACTGCTGCTCGCGTAAAGGCTGCTCTTGCT CGAAGCCTGGTGCCTTACTACCCCTTGGCGGGCCGAG TCAAAACCCGGCCAGACAGCACTGGACTCGACGTGG TGTGTCAAGCTCAGGGCGCGGGGTTACTGGAGGCGG TGTCAGATTACACCGCGTCGGACTTTCAACGGGCCCC ACGGTCCGTGACCGAGTGGAGGAAGTTGTTATTGGTT GAGGTTTTCAAAGTAGTCCCGCCACTGGTGGTTCAGC TGACGTGGCTTTCGGACGGTTGTGTGGCTTTGGGGGT TGGGTTTAGTCACTGTGTCATCGACGGCATTGGAAGC TCCGAATTTCTCAATTTGTTCGCTGAGTTAGCCACTG GCAGAGCCAGACTCAGTGAGTTTCAACCCAAACCGG TCTGGGACCGTCACCTTCTCAACTCAGCGGGTCGGAC CAATCTAGGAACTCACCCCGAGTTCGGCCGAGTCCCT GACCTTTCTGGGTTCGTGACACGGTTTACCCAAGAGC GACTCAGTCCCACTTCAATCACATTCGACAAAACATG GCTTAAAGAATTGAAAAATATCGCCATGTCAACGAGT CAACCCGGTGAGTTCCCCTACACGTCGTTTGAAGTTC TCTCAGGTCATATTTGGAGAAGCTGGGCGAGATCGTT AAACTTACCGGCGAAACAAGTTTTAAAGCTTCTCTTC AGTATCAACATACGAAACCGAGTCAAGCCGAGTCTA CCCGCTGGTTACTACGGCAACGCATTCGTACTCGGCT GCGCGCAAACGTCCGTTAAGGACTTAACGGAGAAGG GGTTGGGTTATTGTGCTGATTTAGTGAGGGGTGCGAA GGAGCGAGTCGGGGACGAGTACGCGAGAGAAGTGGT GGAATCGGTGAGTTGGCCGAGGCGGGCGAGTCCGGA CTCGGTGGGCGTGTTGATTATTTCGCAGTGGTCGAGG CTTGGGCTGGACCGGGTTGACTTTGGGCTGGGCAGGC CGGTCCAAGTGGGGCCAATCTGCTGCGATCGGTACTG CTTGTTTCTGCCGGTTCGCGAATCGACGGAGTCCGTG AAGGTGATGGTGGCGGTCCCTACCAGCGCCGTTGATC GATACGAGTATTTTATCAGGAGCCCCTACTCGTGATC ATGATTGGATCGTGGTTCTTTGACTTTTTGTTGTTTGA CTTTTGAATTCTTTTCTTGATGGGTCTTATTCTGCTTC TGATGCAAAGAATTTTATTTTTCTGGGATGTAATCGT CACACCCGAGTTTTGCCCCCCATGTCGGTTGCTTTGTA GGGACACGTGGTGTTTACTAAATGGAAAAAAAATCTA GTGTTA CTATTGCTCAAAAAAAAAAAA

優(yōu)化后的VAAT基因序列如下：

ATGAACAAAATTGAAGTTTCAATTATTTCTAAGC ATACAATTAAACCATCTACATCTTCTTCACCATTACA GCCATATAAATTGACATTGTTGGATCAATTGACTCCA CCATCTTACGTCCCAATGGTCTTCTTCTATCCAATAAC TGGTCCAGCTGTTTTCAATTTGCAAACTTTGGCAGATT TAAGGCATGCATTGTCTGAAACTTTAACATTGTATTA TCCATTATCTGGTAGAGTCAAAAATAATTTGTATATT GACGACTTCGAGGAGGGTGTCCCATATTTAGAAGCTA GGGTTAACTGTGATATGAACGATTTTTTAAGATTGCC TAAAATAGAATGTTTAAATGAATTTGTTCCAATTAAG CCATTTTCTATGGAAGCTATTTCTGATGAAAGATACC CATTGTTGGGTGTTCAAGTTAATATTTTCAACTCTGGT ATAGCAATTGGTGTTTCAGTTTCACATAAATTGATTGA TGGAAGAACTTCTGATTGTTTTTTAAAGTCTTGGTGCG CTGTTTTCAGGGGTTCTAGAGATAAAATTATTCATCCA AACTTGTCTCAAGCAGCTTTGTTGTTTCCACCAAGAG ATGATTTACCAGAAAAGTATGCAAGACAGATGGAAG GTTTGTGGTTCGTCGGTAAGAAGGTCGCTACTAGGAG GTTCGTCTTCGGTGCTAAGGCTATATCTGTCATTCAGG ATGAGGCTAAGTCTGAGTCTGTCCCAAAGCCATCTAG GGTCCAGGCTGTCACATCTTTCTTATGGAAACATTTG ATTGCTACTTCTAGAGCTTTGACTTCAGGTACTACATC TACTAGATTGTCTATTGCAACACAAGTCGTTAATATT AGATCAAGAAGAAATATGGAAACTGTTTGGGATAAC GCAATTGGTAACTTGATTTGGTTCGCTCCAGCTATTTT GGAATTATCTCACACAACTTTAGAAATATCTGATTTG AAGTTATGTGATTTAGTTAACTTATTGAATGGTTCTGT TAAACAATGTAACGGTGATTACTTCGAAACTTTCATG GGTAAGGAAGGTTATGGATCTATGTGCGAATATTTGG ATTTTCAAAGGACAATGTCATCTATGGAACCAGCTCC AGAAATTTACTTGTTTACTTCATGGACTAACTTCTTTA ATCAATTGGATTTTGGTTGGGGTAGGACATCTTGGAT TGGTGTTGCTGGTAAAATTGAATCTGCTTTTTGCAATT TAACAACTTTGGTCCCAACTCCATGCGACACAGGTAT TGAGGCTTGGGTCAATTTGGAGGAGGAGAAGATGGC TATGTTGGAGCAGGACCCACAGTTTTTGGCTTTGGCT TCTCCTAAGACTTTGATATCTAGATATTAA

以含有合成基因的質(zhì)粒PUC57-AeAT9、PUC57-VAAT為模板，分別用引物AeAT9-U/AeAT9-D、VAAT-U/VAAT-D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到AeAT9基因和VAAT基因。采用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI對質(zhì)粒Yep352-PGK進(jìn)行酶切，將線性化質(zhì)粒Yep352-PGK切膠純化回收后，采用ClonExpressTMⅡ重組克隆試劑盒將其分別與AeAT9基因、VAAT基因進(jìn)行體外重組，得到重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）。

圖1 重組質(zhì)粒Yep352-PGK(AeAT9)（A）和Yep352-PGK(VAAT)（B）的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmids Yep352-PGK(AeAT9)(A) and Yep352-PGK(VAAT) (B)

（3）過表達(dá)AeAT9、VAAT基因重組菌株的構(gòu)建

以釀酒酵母AY12-α的基因組為模板，分別使用引物GA-U/GA-D和GB-U/GB-D PCR擴(kuò)增得到Gal80基因上游同源臂GA基因片段以及下游同源臂GB基因片段；以質(zhì)粒pUG6作為模板，使用引物Kr-U/Kr-D PCR擴(kuò)增得到loxp-KanMX-loxp基因片段；分別以質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）作為模板，使用引物PP-U/PP-D PCR擴(kuò)增得到PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段及PGK1P-VAATPGK1T基因片段。將PCR擴(kuò)增得到的基因片段GA、PGK1PAeAT9-PGK1T、loxp-KanMX-loxp和GB及GA、PGK1P-VAATPGK1T、loxp-KanMX-loxp和GB純化回收后，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[23]分別導(dǎo)入釀酒酵母AY12-α中，經(jīng)過胞內(nèi)同源重組后獲得釀酒酵母單倍體重組菌株α-AeAT9和α-VAAT。同源重組過程見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)化片段的同源重組過程Fig. 2 Homologous recombination process of converted fragments

轉(zhuǎn)化后的菌液經(jīng)修復(fù)培養(yǎng)后，適當(dāng)稀釋涂布于含有300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培后，提取基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

（4）轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記的去除

用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將帶有Cre重組酶的pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌株獲得轉(zhuǎn)化子；挑取轉(zhuǎn)化子的單菌落于半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)12 h，稀釋涂布于YEPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d。將長出的單菌落在YEPD培養(yǎng)基和含300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基上進(jìn)行影印點(diǎn)板，挑出在YEPD培養(yǎng)基上生長而在G418抗性培養(yǎng)基上不生長的菌株，提取其基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。若以該基因組為模板擴(kuò)增KanMX片段，無法得到1 600 bp左右的條帶，而以轉(zhuǎn)化前的重組菌株的基因組為模板則能擴(kuò)增得到該基因片段，證明菌株成功去除KanMX篩選標(biāo)記。

1.3.2 生長曲線的測定

分別從斜面上挑取一環(huán)菌株AY12-α、α-AeAT9和α-VAAT接種于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，混勻，分別取10 μL、12 μL、14 μL和16 μL菌液依次加入含有390μL、388μL、386μL和384μLYEPD液體培養(yǎng)基的100孔板的孔中，取400 μL YEPD液體培養(yǎng)基做空白對照。將100孔板放置于全自動生長曲線測定儀中，30 ℃培養(yǎng)，每隔1 h測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。以培養(yǎng)時(shí)間（X）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.3 白酒液態(tài)模擬發(fā)酵[21]

以親本菌株AY12-α作為對照，取一環(huán)保藏在固體斜面上的待發(fā)酵菌株α-AeAT9、α-VAAT接種于裝有5 mL一級發(fā)酵種子培養(yǎng)基的試管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。將一級培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入45 mL二級發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)16～17 h。測定菌液OD600nm值，取相應(yīng)體積換算成相同菌體數(shù)量（1.8×109CFU/mL）接種到135 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。發(fā)酵期間，每隔12 h稱一次質(zhì)量，稱質(zhì)量前充分搖晃三角瓶，盡量將瓶中的CO2排凈，當(dāng)兩次失質(zhì)量＜1 g，表明發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后對各菌株的CO2失質(zhì)量、酒精度、還原糖、高級醇和酯類物質(zhì)的產(chǎn)量進(jìn)行測定。

1.3.4 測定方法

CO2失質(zhì)量、酒精度、還原糖含量的測定：按照參考文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行。

乙酸含量的測定[21]：將發(fā)酵液進(jìn)行10倍稀釋，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀測定。HPLC條件：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），柱溫為60 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流動相為5 mmol/L的稀硫酸，流速為0.6 mL/min，檢測器為示差折光檢測器。

高級醇和酯類含量的測定[25]：將100 mL發(fā)酵液和100 mL水混勻后進(jìn)行蒸餾，蒸餾出100 mL的酒樣。將酒樣經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，采用氣相色譜儀測定。GC條件：Agilent1909N-213（30 m×0.32 mm×0.5 μm）毛細(xì)血管色譜柱，檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1，載氣為高純度的氮?dú)猓∟2），流速為2.0 mL/min，程序升溫（起始柱溫50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min的升溫速度上升至120 ℃，保持5 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）的構(gòu)建

為了以強(qiáng)啟動子PGK1p對來自獼猴桃和草莓的醇?；D(zhuǎn)移酶基因AeAT9、VAAT進(jìn)行過表達(dá)，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和質(zhì)粒Yep352-PGK（VAAT），采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒Yep352-PGK(AeAT9)和Yep352-PGK(VAAT)的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig. 3 PCR verification results of recombiant plasmids Yep352-PGK(AeAT9) and Yep352-PGK(VAAT)

由圖3可知，以重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）為模板PCR擴(kuò)增得到堿基長度為1 299 bp的AeAT9基因片段和堿基長度為3 036 bp的PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段，以重組質(zhì)粒Yep352-PGK（VAAT）為模板PCR擴(kuò)增得到堿基長度為1 368 bp的VAAT基因片段和堿基長度為3 105 bp的PGK1P-VAAT-PGK1T基因片段。PCR驗(yàn)證結(jié)果與理論預(yù)期一致，表明PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段和PGK1P-VAATPGK1T基因片段成功插入Yep352-PGK質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處，重組質(zhì)粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）構(gòu)建成功。

2.2 過表達(dá)醇?；D(zhuǎn)移酶基因AeAT9、VAAT重組菌株的構(gòu)建

2.2.1 過表達(dá)AeAT9、VAAT基因轉(zhuǎn)化子的獲得

采用引物D1-U/DA-D、DA-U/D2-D、D3-U/D3-D和D1-U/DV-D、DV-U/D2-D、D3-U/D3-D分別對重組菌株α-AeAT9和α-VAAT進(jìn)行上、中、下游定點(diǎn)PCR驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 重組菌株α-AeAT9和α-VAAT的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 PCR verification results of recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由圖4可知，分別以提取的α-AeAT9和α-VAAT轉(zhuǎn)化子基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用上游引物D1-U/DA-D、D1-U/DV-D PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物堿基長度均在3 700 bp左右；采用中游引物DA-U/D2-D、DV-U/D2-D PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物堿基長度均在3 200 bp左右；采用下游引物D3-U/D3-D PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物堿基長度均在2 700 bp左右；上述條帶大小均與理論預(yù)期一致，且出發(fā)菌株AY12-α的陰性對照均無條帶。說明重組盒GA-PGK1P-AeAT9-PGK1T-loxp-KanMXloxp-GB、GA-PGK1P-VAAT-PGK1T-loxp-KanMX-loxp-GB已分別成功導(dǎo)入到釀酒酵母AY12-α基因組中，并且重組位置正確，獲得了正確的α-AeAT9和α-VAAT轉(zhuǎn)化子。

2.2.2 轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記KanMX的去除

通過1.3.1的方法去除α-AeAT9和α-VAAT轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記KanMX，分別以其基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

圖5 重組菌株去除KanMX篩選標(biāo)記PCR驗(yàn)證Fig. 5 Verification of screening marker KanMX removal of recombinant strains by PCR

由圖5可知，以轉(zhuǎn)化pGAPza質(zhì)粒前后的重組菌株基因組為模板，通過引物Kr-U/Kr-D獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，前者作為陽性對照均有1 600 bp左右的特異性條帶，后者均無條帶，該結(jié)果與理論預(yù)期相符，證明菌株α-AeAT9和α-VAAT成功去除KanMX篩選標(biāo)記。

2.3 重組菌株的生長性能

親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的生長曲線見圖6。

圖6 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT生長性能的比較Fig. 6 Comparison of growth characteristics of parent strain AY12-α and recombiant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由圖6可知，重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的生長速率與出發(fā)菌株AY12-α保持一致，而且最終達(dá)到的最大生物量基本一致，說明AeAT9、VAAT基因的過表達(dá)對菌株的生長基本無影響。

2.4 重組菌株的基本發(fā)酵性能

以親本菌株AY12-α作為對照組，對重組菌株α-AeAT9、α-VAAT進(jìn)行白酒液態(tài)模擬發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵周期為4 d。發(fā)酵結(jié)束后對各菌株的基本發(fā)酵性能進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT發(fā)酵性能的比較Table 3 Comparison of fermentation characteristics of parent strain AY12-α and recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由表3可知，重組菌株α-AeAT9、α-VAAT和出發(fā)菌株AY12-α在相同條件下發(fā)酵結(jié)束后，CO2總質(zhì)量損失、還原糖含量和酒精度無顯著變化（P＞0.05），表明本實(shí)驗(yàn)中的基因敲除和過表達(dá)的操作不會對菌株基本發(fā)酵性能產(chǎn)生不利影響。從乙酸的產(chǎn)量變化來看，重組菌株與親本菌株相比，乙酸的積累量顯著降低（P＜0.05）。該結(jié)果表明醇?；D(zhuǎn)移酶AeAT9、VAAT催化乙醇和乙酰輔酶A反應(yīng)生成乙酸乙酯，致使更多的乙酸通過乙酰輔酶A合成酶轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，從而使得乙酸減少；同時(shí)，重組菌株α-AeAT9的乙酸積累量顯著低于重組菌株α-VAAT（P＜0.05），表明醇?；D(zhuǎn)移酶AeAT9對于合成乙酸乙酯的催化效率高于VAAT。

表4 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT高級醇及酯生成量的比較Table 4 Comparison of higher alcohols and esters content between parent strainAY12-α and recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT mg/L

2.5 重組菌株的醇酯生成量

重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的高級醇和酯產(chǎn)量見表4。

由表4可知，重組菌株α-AeAT9和α-VAAT的乙酸乙酯生成量分別為（792.26±10.04）mg/L和（204.19±5.83）mg/L，分別為出發(fā)菌株AY12-α的55.40倍和14.28倍。結(jié)果表明醇?；D(zhuǎn)移酶AeAT9、VAAT對于乙酸乙酯的合成有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），且醇?；D(zhuǎn)移酶AeAT9的作用效果顯著優(yōu)于VAAT（P＜0.05）。另外重組菌株的乙酸異戊酯的生成量較出發(fā)菌株變化趨勢與乙酸乙酯一致。值得注意的是，重組菌株的主要高級醇（異丁醇、異戊醇、正丙醇、苯乙醇）總含量分別為（152.77±2.14）mg/L和（190.04±2.63）mg/L，較出發(fā)菌株降低了37.10%和21.75%，其中異戊醇的生成量變化最為明顯，可能是由于醇酰基轉(zhuǎn)移酶AeAT9、VAAT催化異戊醇和乙酰輔酶A縮合形成乙酸異戊酯的結(jié)果[18-20]。

3 結(jié)論

在釀酒酵母菌株AY12-α中，分別引入來自綠色植物獼猴桃和草莓的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因AeAT9、VAAT，成功構(gòu)建了重組菌株α-AeAT9、α-VAAT。重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的乙酸乙酯生成量分別為（792.26±10.04）mg/L和（204.19±5.83）mg/L，分別為親本菌株的55.40倍和14.28倍；主要高級醇總含量分別為（152.77±2.14）mg/L和（190.04±2.63）mg/L，較親本菌株分別降低37.10%和21.75%。本實(shí)驗(yàn)為提高釀酒酵母酯類合成及降低高級醇的研究提供了思路和參考；同時(shí)該研究所獲得的高產(chǎn)乙酸乙酯的重組菌株在白酒生產(chǎn)中有一定的應(yīng)用潛力，有利于提高白酒的風(fēng)味和質(zhì)量。