海洋紅球菌分離鑒定及其產(chǎn)油脂和色素的研究

李 鋒，王巧貞，黃德娜，黃庶識(shí)*

（1.黔南民族師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻558000；2.廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530007）

化石能源的大量消耗，致使全球環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，因此迫切需要尋求清潔可再生能源替代化石資源。生物柴油因其燃燒性能好、熱值高和污染小[1]，備受各國(guó)能源生產(chǎn)企業(yè)和研究者們的廣泛關(guān)注。當(dāng)前，市場(chǎng)上生產(chǎn)生物柴油的主要原料來(lái)源于植物油、動(dòng)物脂肪或餐余廢棄油類，但其生產(chǎn)成本較高，成為制約生物柴油發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。自然界中存在大量真菌、細(xì)菌或者微藻能夠利用碳?xì)浠衔锘蛱妓衔锖铣捎椭琜2-4]，其中微生物具有生長(zhǎng)速度快和易培養(yǎng)等特點(diǎn)，具備商業(yè)開(kāi)發(fā)的潛力。

目前，已報(bào)道的微生物油脂主要集中于以葡萄糖為碳源，較少微生物可以利用木糖產(chǎn)油脂，這樣的模式必然會(huì)造成生產(chǎn)成本較高，從而制約微生物油脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，采用廉價(jià)生產(chǎn)原料是生物柴油能否規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。木質(zhì)纖維素水解后的主要產(chǎn)物為葡萄糖、木糖和木質(zhì)素，如果微生物能夠同時(shí)利用葡萄糖、木糖、木質(zhì)素及其衍生物為碳源合成油脂，對(duì)微生物油脂產(chǎn)業(yè)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，相關(guān)研究表明紅球菌屬（Rhodococcussp.）細(xì)菌可以利用葡萄糖、木質(zhì)素及其衍生物產(chǎn)油脂，如不透明紅球菌（Rhodococcus opacus）[5]、弗氏紅球菌（Rhodococcus wratislaviensis）、紅球菌（Rhodococcus jostii）[6]和紅球菌YHY01[7]等。此外，有研究發(fā)現(xiàn)紅球菌屬細(xì)菌還可以產(chǎn)色素，陳亞淑等[8]對(duì)海洋紅球菌（Rhodococcussp.）B7740產(chǎn)類胡蘿卜素進(jìn)行提取，并發(fā)現(xiàn)該色素具有體外抗氧化活性和抗增殖活性。于淼等[9]從土壤中分離得到一株可以產(chǎn)紅色素的赤紅球菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化后，其紅色素粗產(chǎn)品可達(dá)到0.93 g/L。近年來(lái)天然微生物色素逐漸受到人們關(guān)注，它不僅可以賦予產(chǎn)品豐富單位色彩，而且具有多種生理功能，并與人類健康有著密切關(guān)系，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)[10-12]。因此，利用紅球菌產(chǎn)油脂和色素具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

本研究以海洋環(huán)境中篩選的能夠同時(shí)利用葡萄糖、木糖和木質(zhì)素產(chǎn)油脂和色素的紅球菌為研究對(duì)象，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并初步探討培養(yǎng)條件對(duì)其生物量的影響，以期為紅球菌利用木質(zhì)纖維素（或其他類型生物質(zhì)）水解液合成油脂和天然色素的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017年7月于廣西北部灣茅尾海紅樹(shù)林濕地采集不同類型植物根系土壤15份，保存在無(wú)菌密封袋中，將樣品置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于細(xì)菌的篩選分離。

堿木質(zhì)素：美國(guó)Sigma公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑、Ezup柱式細(xì)菌基因組提取劑盒、瓊脂糖、細(xì)菌通用引物（27F和1492R）：上海生工生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

分離培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉2.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO40.2 g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，CuSO40.001 g/L，瓊脂15.0 g/L，碳源（葡萄糖、木糖或堿木質(zhì)素）2.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源10g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母粉2.5g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO40.2 g/L，K2HPO41.0 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，CuSO40.001 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高溫蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；730R回轉(zhuǎn)振蕩恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó)APlus公司；S1000TM PCR儀：美國(guó)Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)有限公司；DYY-6D電泳儀：北京六一生物科技有限公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)：北京普析儀器有限公司；WGD-30S凝膠成像儀：韓國(guó)Wisd公司；TE2000-U尼康倒置顯微鏡：日本尼康株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選及分離純化

將采集紅樹(shù)林植物根際土壤用無(wú)菌水稀釋至10-1～10-4，吸取50 μL涂布于分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于30 ℃培養(yǎng)箱3～5 d后，觀察培養(yǎng)基中菌落形狀、顏色、表面光滑度等。挑取有顏色單菌落繼續(xù)分離純化。單菌落經(jīng)3次分離純化后進(jìn)行革蘭氏染色，將其中的革蘭氏陽(yáng)性菌劃線于以葡萄糖、木糖或者木質(zhì)素為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取能夠在3種碳源上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌顯微形態(tài)觀察：取細(xì)菌培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后，吸微量液體置于潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用高倍顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，分離得到所有純化的單菌落標(biāo)記后，用25%甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.3.2 生理生化特征分析

根據(jù)菌株的表型特征、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，以及碳源（葡萄糖、木糖、果糖等糖類物質(zhì)和乙酸、琥珀酸等有機(jī)酸類物質(zhì)）利用生長(zhǎng)情況，并參照已報(bào)道文獻(xiàn)中類似屬種細(xì)菌的生理生化特征，初步確定菌株分類學(xué)地位。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌基因組采用Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。以基因組為模板，進(jìn)行16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增。細(xì)菌擴(kuò)增通用正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR具體操作步驟參考文獻(xiàn)[13]。菌株的PCR產(chǎn)物凝膠成像檢測(cè)合格后，送上海生工進(jìn)行測(cè)序。最終獲得序列拼接后，提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation，NCBI）網(wǎng)站基本局部比對(duì)搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取多個(gè)近似菌株序列利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以確定其分類學(xué)地位。

1.3.4 菌株TH-22培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

在100 mL的培養(yǎng)體系中，接種量2%條件下培養(yǎng)120 h，分別測(cè)定不同碳源（10 g/L葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、半乳糖和1 g/L堿木質(zhì)素）、溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、轉(zhuǎn)速（100 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、200 r/min）和NaCl含量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）對(duì)菌株TH-22生長(zhǎng)狀況的影響，以生物量（干質(zhì)量）作為考察指標(biāo)。其中不同碳源生長(zhǎng)情況采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳碳源后，采用發(fā)酵培養(yǎng)基考察其他因素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。細(xì)菌適宜培養(yǎng)條件確定后，考察菌株TH-22利用葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖和堿木質(zhì)素等碳源合成色素和油脂的能力。

1.3.5 分析方法

菌體干質(zhì)量的測(cè)定：取50 mL培養(yǎng)液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集離心管底部菌體，將其置于真空冷凍干燥機(jī)中，24 h后取出干燥菌體并稱取菌體干質(zhì)量。

色素的提取及測(cè)定[14]：取50 mL培養(yǎng)液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集離心管底部菌體，用去離子水重新懸浮菌體并反復(fù)洗滌，菌體沉淀中加入30 mL無(wú)水乙醇混勻，將其置于冰浴中進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，超聲功率200 W，超聲時(shí)間30 min，超聲時(shí)間隔5 s，離心后的色素提取液，在波長(zhǎng)300～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定色素的最大吸收波長(zhǎng)及吸光度值，用如下公式計(jì)算色素產(chǎn)量：

式中：A為色素在最大波長(zhǎng)下的吸光度值；D為稀釋倍數(shù)；V為溶劑體積，mL；0.16為色素摩爾消光系數(shù)；W為色素提取所用的細(xì)胞干質(zhì)量，g；c為發(fā)酵液中細(xì)胞質(zhì)量濃度，g/L。

細(xì)菌胞內(nèi)油脂的提取及含量測(cè)定[15]：將1 g濕菌體置于10 mL鹽酸（4 mol/L）溶液中，重懸菌體混勻后，放置20 min，然后沸水浴10 min，將經(jīng)過(guò)沸水浴的離心管置于-20 ℃冰箱中冰浴30 min，在離心管中分別接入10 mL甲醇和氯仿，振蕩30 min，5 000 r/min離心3 min，靜置分層后，取下部氯仿層，65 ℃干燥2 h，稱取干燥后油脂質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及分離純化

選取分離培養(yǎng)基中一株橙黃色的菌落，對(duì)其進(jìn)一步劃線分離純化，得到菌株TH-22。

2.2 菌株TH-22的形態(tài)及生理生化特征

觀察菌株TH-22生長(zhǎng)顏色、大小及菌落形態(tài)并進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株TH-22呈現(xiàn)橙黃色、圓形、表面圓潤(rùn)光滑，邊緣整齊；色素只產(chǎn)在胞內(nèi)，培養(yǎng)基中無(wú)色素。革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，顯微鏡下觀察菌體呈現(xiàn)多種形態(tài)，如球狀和短桿狀，與文獻(xiàn)報(bào)道紅球菌屬細(xì)菌類似[16]。

圖1 菌株TH-22菌落形態(tài)（a）以及顯微形態(tài)（b）Fig. 1 Colony morphology (a) and microscopic morphology (b) of strain TH-22

菌株TH-22接種于液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，觀察以木糖、葡萄糖、堿木質(zhì)素和有機(jī)酸等作為唯一碳源的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，該菌可以利用單糖、多糖等多種糖類以及小分子有機(jī)酸和芳香族有機(jī)酸作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，與已報(bào)道的赤紅球菌生理生化特征基本一致[9，17]。

表1 菌株TH-22的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of physiological and biochemical characteristics of stain TH-22

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株TH-22基因組為模板，27F和1492R為引物進(jìn)行16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，序列在1 500 bp左右，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。將雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，提交至NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的11株細(xì)菌序列，利用MEGA5.05計(jì)算細(xì)菌序列相似度，同時(shí)利用鄰接法構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株TH-22與赤紅球菌（Rhodococcus ruber）在同一個(gè)分支上，同源性達(dá)到99%。因此，結(jié)合菌株TH-22的菌落形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，菌株TH-22被鑒定為赤紅球菌（Rhodococcus ruber）。

圖2 基于16S rRNA基因序列菌株TH-22的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain TH-22

2.4 紫外/可見(jiàn)吸收光譜分析

采用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)300～600 nm范圍內(nèi)對(duì)乙醇提取色素溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株TH-22的色素提取液在波長(zhǎng)460 nm處存在最高吸收峰，因此，確定菌株TH-22可以產(chǎn)類胡蘿卜素類的物質(zhì)，色素的最大吸收波長(zhǎng)為460 nm。

圖3 菌株TH-22胞內(nèi)色素乙醇提取液的紫外/可見(jiàn)吸收光譜圖Fig. 3 Spectrum of intracellular pigment ethanol extracting solution of strain TH-22

2.5 培養(yǎng)條件對(duì)菌株TH-22生長(zhǎng)的影響

2.5.1 碳源對(duì)細(xì)菌生物量的影響

由圖4可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株TH-22的生物量可達(dá)8.99 g/L，其次為果糖，生物量為8.86 g/L，其他碳源對(duì)生物量的影響依次為蔗糖、半乳糖和木糖；而以堿木質(zhì)素為碳源時(shí)，菌株TH-22的生物量?jī)H達(dá)到1.75 g/L，可能是由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其在同化過(guò)程中需要先被降解為小分子芳香族化合物，從而造成其生長(zhǎng)緩慢。因此，選擇葡萄糖作為菌株合成油脂和色素的最佳碳源。

圖4 碳源對(duì)菌株TH-22生物量的影響Fig. 4 Effect of carbon sources on the biomass of strain TH-22

2.5.2 溫度對(duì)細(xì)菌生物量的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，菌株TH-22的生物量也逐漸升高，其中在35 ℃時(shí)，其生物量達(dá)到最高值10.1 g/L；當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，其生物量明顯降低，僅為3.62 g/L。故確定該菌的最適宜生長(zhǎng)溫度為35 ℃。

圖5 溫度對(duì)菌株TH-22生物量的影響Fig. 5 Effect of temperature on the biomass of strain TH-22

2.5.3 初始pH對(duì)細(xì)菌生物量的影響

由圖6可知，培養(yǎng)環(huán)境的初始pH對(duì)菌株TH-22的生物量影響較大，隨著培養(yǎng)基中初始pH的不斷升高，其初始pH=6.0時(shí)，生物量為6.11 g/L，當(dāng)初始pH=7.5時(shí)，生物量增加至11.76 g/L，而當(dāng)初始pH=8.0時(shí)，其生物量開(kāi)始減少；由此表明該菌適宜在中性環(huán)境中生長(zhǎng)，偏酸或者偏堿的培養(yǎng)體系都會(huì)影響菌株TH-22的正常代謝，因此確定該菌的適宜生長(zhǎng)pH為7.5。

圖6 初始pH值對(duì)菌株TH-22生物量的影響Fig. 6 Effect of initial pH value on the biomass of strain TH-22

2.5.4 轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生物量的影響

由圖7可知，隨著轉(zhuǎn)速升高，菌株TH-22的生物量逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，達(dá)到最大生物量為10.88 g/L，在低轉(zhuǎn)速時(shí)，其生物量較低可能是由于培養(yǎng)體系溶氧不足導(dǎo)致的。而在高轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)環(huán)境中，雖然溶氧充足，但轉(zhuǎn)速太高時(shí)，由于剪切力的作用，可能會(huì)引起菌體損傷，從而導(dǎo)致菌體生物量減少，故選擇轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株TH-22生物量的影響Fig. 7 Effect of rotation speed on the biomass of strain TH-22

2.4.5 NaCl含量對(duì)細(xì)菌生物量的影響

菌株TH-22來(lái)源于海洋環(huán)境，可能具備不同于陸地微生物等生物遺傳特征。培養(yǎng)體系中NaCl維持細(xì)菌體內(nèi)的內(nèi)外滲透壓、細(xì)胞內(nèi)外的電勢(shì)差和參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔玫裙δ躘18]。在NaCl含量為0.5%～3.0%時(shí)，考察細(xì)菌生物量的變化。

圖8 NaCl含量對(duì)菌株TH-22生物量的影響Fig. 8 Effect of NaCl contents on the biomass of strain TH-22

由圖8可知，菌株TH-22在NaCl含量為0.5%～3.0%時(shí)，均能夠生長(zhǎng)，但NaCl含量＜1.0%時(shí)利于細(xì)菌生長(zhǎng)，其中在NaCl含量為1.0%時(shí)，其生物量為11.5 g/L，因此選擇培養(yǎng)基中NaCl含量為1.0%。

2.6 菌株TH-22利用不同碳源產(chǎn)油脂和色素初探

本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株TH-22利用四種糖類物質(zhì)（葡萄糖、木糖、蔗糖和果糖）合成油脂和色素進(jìn)行評(píng)價(jià)。按照接種量為2%分別接種于4種碳源質(zhì)量濃度10 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、初始pH為7.5和NaCl含量為1%的條件下培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌株TH-22胞內(nèi)的油脂和色素產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株TH-22的胞內(nèi)油脂和色素產(chǎn)量Table 2 Yield of intracellular lipid and pigment of stain TH-22

由表2可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，其油脂和色素產(chǎn)量最高分別為（2.87±0.15）g/L和（3.88±0.28）mg/L；其次，油脂和色素產(chǎn)量依次分別為果糖、蔗糖和木糖。本試驗(yàn)結(jié)果與分離自北極海水的紅球菌B7740產(chǎn)色素相似[14]，都是以葡萄糖為碳源時(shí)，其色素產(chǎn)量最高；而分離自土壤中的紅球菌ZA-UR6以蔗糖為碳源時(shí)[19-20]，其色素產(chǎn)量最高；由此表明細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致了所需營(yíng)養(yǎng)不同。菌株TH-22可以利用多種糖類物質(zhì)，因此后續(xù)研究需要繼續(xù)探索廉價(jià)的培養(yǎng)基質(zhì)，如農(nóng)作物秸稈水解液、甘蔗和菊芋水解液等。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從北部灣紅樹(shù)林濕地海泥中篩選到一株能夠產(chǎn)油脂和色素的放線菌TH-22，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性檢測(cè)和分子生物學(xué)鑒定菌株TH-22為赤紅球菌（Rhodococcus ruber）。菌株TH-22可以利用多種糖類物質(zhì)產(chǎn)油脂和色素，其中葡萄糖為最佳碳源。此外，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、初始pH為7.5和NaCl含量為1%。在此優(yōu)化條件下，以10 g/L葡萄糖為碳源，菌株TH-22的油脂和色素產(chǎn)量分別為（2.87±0.15）g/L和（3.89±0.28）mg/L。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究紅球菌利用生物質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。