海棠酵素微生物菌相分析及其功能初步研究

陳 寵，蘇亞平，岳雅欣，高保軍，孫海娟，王金菊，王艷萍*

（1.天津科技大學 食品科學與生物工程學院，天津300457；2.山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 濱州256500）

食用酵素是指以動物、植物和食用菌等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素產(chǎn)品[1]，由于其具有良好的口感和多種健康功能而深受消費者的喜愛[2-3]。

海棠酵素作為人們喜愛的水果類酵素，含有多糖、有機酸、短鏈脂肪酸、氨基酸、生物活性肽、生物酶、多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)[4-5]，賦予酵素多種功能，具有生津止渴、健脾止瀉的作用，治療消化不良、食積腹脹、增強對疾病的抵抗力等功能，目前對海棠酵素的研究主要在發(fā)酵條件和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化方面；楊志鵬等[6]報道了以海棠果果汁為主要原料，通過鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）217-3發(fā)酵，研究了海棠酵素的發(fā)酵條件；劉維兵等[7]報道了葡萄海棠果酵素發(fā)酵工藝的優(yōu)化及體外抑菌與抗氧化活性。酵素的生產(chǎn)是一個及其復雜的發(fā)酵過程，特別是其中參與發(fā)酵的微生物的種類及其在發(fā)酵過程中的變化，對酵素的生產(chǎn)起著關鍵作用。邸鵬月等[8]采用宏基因組技術分析桑葚酵素發(fā)酵前、中、后期微生物的豐度及多樣性發(fā)現(xiàn)，桑葚酵素發(fā)酵過程中細菌較真菌豐富，其優(yōu)勢菌是乳桿菌屬；馬蓉等[9]報道了黑果枸杞酵素發(fā)酵過程中理化成分變化及微生物類型分析，獲得了1種酵母菌，為庫德里阿茲威畢赤氏酵母菌（Pichia kudriavzevii），1種曲霉菌，為短青霉菌（Penicillium brevicompactum），2種乳酸菌，為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），為黑果枸杞酵素接種發(fā)酵提供特定菌種，并能夠調(diào)控黑果枸杞酵素發(fā)酵過程中的理化成分變化及微生物生長規(guī)律；趙菲等[10]采用高通量測序技術研究魚腥草酵素對小鼠腸道菌群的影響。

酵素作為一款新型的發(fā)酵食品，眾多酵素產(chǎn)品的功能特性、發(fā)酵過程的控制尚不清楚。目前，對其發(fā)酵理論研究、生產(chǎn)工藝研究和功能作用機制的研究也較少。一方面，由于目前多數(shù)酵素產(chǎn)品采用自然發(fā)酵，其生產(chǎn)工藝和發(fā)酵菌種容易受到環(huán)境條件的影響，導致產(chǎn)品的品質(zhì)和質(zhì)量不穩(wěn)定，因此對酵素發(fā)酵過程中微生物菌相的分析及對發(fā)酵微生物的了解就顯得非常重要。目前，關于海棠酵素中微生物菌相的研究還尚未相關報道，本研究采用高通量測序技術，對海棠酵素發(fā)酵過程中的微生物菌相構(gòu)成進行分析；同時采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法分離、純化海棠酵素發(fā)酵的優(yōu)勢微生物菌種，了解其發(fā)酵過程優(yōu)勢微生物，并獲得純培養(yǎng)物，為海棠酵素的接種發(fā)酵提供理論基礎和菌種資源；最后，通過小鼠動物實驗，研究海棠酵素對小鼠腸道菌群的影響，為揭示海棠酵素的益生功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

海棠酵素：山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.2 試劑革蘭氏染色試劑盒：南京建成生物有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市化學試劑一廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

溴甲酚綠（bromocresol green，BCG）牛乳培養(yǎng)基：天津市江天化工技術有限公司；溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基：天津市博迪化工有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：天津市江天化工技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HVA-85型全自動高壓蒸汽滅菌器：天津福寶德科技發(fā)展有限公司；Multiskan GO型酶標儀：美國Thermo公司；YS100生物顯微鏡：日本NIKON公司；HFsafe 900型超凈工作臺：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海棠酵素活菌數(shù)分析及菌株分離

將海棠酵素搖晃均勻，吸取500 μL到裝有4.5 mL無菌生理鹽水的試管中，按10倍系列梯度稀釋至10-6，分別取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液100 μL分別涂布于BCG牛乳培養(yǎng)基（用于乳酸菌的分離）、YPD培養(yǎng)基（用于酵母菌的分離）、溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基（用于醋酸菌的分離）中，作3次平行試驗[11]。將BCG牛乳培養(yǎng)基置于37 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，將YPD培養(yǎng)基置于30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，將溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基置于28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落形態(tài)并計數(shù)。挑選單個菌落進行顯微鏡觀察，同時記錄菌體的形態(tài)特征。將純化后的菌株采用甘油-80 ℃保藏并編號。

1.3.2 分離菌株的分子生物學鑒定

參照文獻[11]，采用細菌16S rDNA通用引物對細菌的16S rDNA序列進行PCR擴增。參照文獻[11]，采用真菌18S rDNA對真菌的18S rDNA序列進行PCR擴增。通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行分析，將PCR擴增產(chǎn)物純化后委托蘇州GENEWIZ公司進行測序。將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST），選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA或18SrDNA序列，采MEGA7.0.14軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 海棠酵素發(fā)酵過程中微生物菌相變化分析

當海棠酵素發(fā)酵至0 d、4 d、13 d、20 d、25 d、31 d時取樣，委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行高通量測序，研究海棠酵素發(fā)酵過程中菌相變化情況。

海棠酵素的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）種類分析：OTU數(shù)量可以代表物種的豐度[12]，將分析得到的序列按照相似性進行歸類，將序列相似度＞97%的序列定義為一個OTU[13]。

海棠酵素細菌和真菌菌群結(jié)構(gòu)分析：通過R語言統(tǒng)計和分析作圖，可得各樣本在不同分類水平下含量較高的前30種微生物菌相的相對豐度圖，展示海棠酵素微生物群落組成的種類和相對含量[14]。

海棠酵素菌相的a多樣性分析：主要包括超1（Chao1）指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)和Coverage指數(shù)，其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)為菌群豐度指數(shù)；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為菌群多樣性指數(shù)[15-16]；Coverage指數(shù)代表樣本的測序深度，是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高則樣本中序列沒有被測出的概率越低[17-18]。

1.3.4 海棠酵素改善小鼠腸道菌群功能探究

小鼠糞便的收集：選取6周齡雄性昆明小鼠16只，隨機分為空白組和實驗組，每組8只。空白組小鼠灌胃0.86%生理鹽水，實驗組小鼠灌胃海棠酵素原液，每天灌胃一次，灌胃0.4 mL，連續(xù)灌胃28 d。取空白組灌胃28 d后和實驗組小鼠灌胃0 d和28 d后的3組小鼠糞便，依次命名為K組（空白組）、G組（灌胃前組）、S組（實驗組）委托谷禾健康生物科技公司進行小鼠腸道菌群分析。

采用俞赟霞等[19]的方法，對3組小鼠糞便進行高通量測序，分析不同分類水平上微生物組成差異及變化情況和微生物多樣性，研究海棠酵素改善小鼠腸道菌群的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 海棠酵素中微生物組成及含量分析

海棠酵素中活菌統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知，海棠酵素中乳酸菌、醋酸菌、酵母菌含量分別為（4.4±0.1）×107CFU/mL、（5.4±0.1）×108CFU/mL和（5.0±0.2）×105CFU/mL。

表1 海棠酵素中微生物含量Table 1 Microbial content in Malus spectabilis Jiaosu

2.2 海棠酵素中微生物的分離及鑒定

通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法從海棠酵素產(chǎn)品中共分離純化出9株菌株，其編號及形態(tài)見表2，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表2 海棠酵素中分離菌株的菌落及細胞形態(tài)Table 2 Colony and cell morphology of strains isolated from Malus spectabilis Jiaosu

圖1 分離細菌（a）及真菌（b）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of isolated bacteria (a) and fungi (b)

由表2及圖1可知，分離得到的9株菌株中包括4株乳酸菌、2株醋桿菌、3株酵母菌，通過與NCBI網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)細菌的菌種分類歸屬如下：菌株1498、1500與模式菌株Lactobacillus plantarumstrain SPC-SNU 72-2遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1498、1500歸屬為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；菌株1502與模式菌株Lactobacillus parafarraginisstrain OCLP1遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1502歸屬為類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraginis）；菌株1524與模式菌株Lactobacillus paracaseistrain SKB1196遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1524歸屬為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）；菌株1526與模式菌株Acetobacter tropicalisstrain AFF6遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1526歸屬為熱帶醋桿菌（Acetobacter tropicalis）；菌株1528與模式菌株Acetobacter lovaniensisstrain Y18遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1528歸屬為羅旺醋酸桿菌（Acetobacter lovaniensis）。所分離出的真菌的分類進化為：菌株1504與模式菌株Rhodotorulasp. strain RY-R-39遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1504歸屬為粘紅酵母屬（Rhodotorula）；菌株1703與模式菌株Candida ethanolicastrain SV3遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1703歸屬為乙醇假絲酵母（Candida ethanolica）；菌株1705與模式菌株Pichia deserticolastrain UCDFST 77-10遺傳距離較近，聚于一支，因此，將菌株1705歸屬為Pichia deserticola。

2.3 海棠酵素微生物菌相分析

2.3.1 海棠酵素發(fā)酵過程中微生物菌相豐富度分析

海棠酵素發(fā)酵過程中（0～31 d）微生物菌相豐富度分析結(jié)果見表3。由表3可知，細菌OTU數(shù)在發(fā)酵0～4 d由4種增加為29種，發(fā)酵4～31 d由29種逐漸減少為3種；真菌OTU數(shù)在發(fā)酵過程中（0～31 d）逐漸減少，由0 d的8種減少為到31 d的2種。這可能是因為海棠酵素發(fā)酵后期，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏導致微生物間進行競爭，微生物種類減少。海棠酵素在發(fā)酵31 d時的細菌豐富度高于真菌，與海棠酵素活菌計數(shù)結(jié)果相一致。

社會實踐的發(fā)展，不斷提出需要解決的新課題，推動著人類的認識不斷發(fā)展，人們在總結(jié)實踐提供的新經(jīng)驗基礎上，提出新理論，解決新問題。我國北方某縣在20世紀80年代開始發(fā)展大田糧食作物噴灌，不僅有效緩解了當?shù)剞r(nóng)業(yè)用水緊缺狀況，增加了城市供水，取得了實實在在的節(jié)水效益，而且在噴灌工程建設過程中充分調(diào)動多方積極性，做到了國家和地方、集體和農(nóng)民共同投入，同時將土地經(jīng)營規(guī)模適度集中，創(chuàng)造了噴灌技術的良好應用條件，加之良好的管理維護和澆地專業(yè)隊等服務網(wǎng)絡保障了噴灌系統(tǒng)的良好運行。正是因為對噴灌技術與設備的再認識，又把這些認識再次應用到具體的實踐中去，在新的認識水平上開展農(nóng)業(yè)節(jié)水噴灌工作，才取得了長久效益。

表3 海棠酵素發(fā)酵過程中微生物豐富度變化Table 3 Changes of microbial richness during Malus spectabilis Jiaosu fermentation

2.3.2 海棠酵素發(fā)酵過程中微生物組成分析

海棠酵素發(fā)酵過程中（0～31 d）細菌菌群的組成見圖2。由圖2可知，在門水平上，海棠酵素發(fā)酵各個時間段95%以上為厚壁菌門（Firmicutes）；在綱水平上，海棠酵素在發(fā)酵過程中主要為芽孢桿菌綱（Bacillibacteria），在發(fā)酵第4天時還出現(xiàn)了梭菌綱（Clostridia）和擬桿菌綱（Bacteroidia）；在目水平上，發(fā)酵過程中主要為乳桿菌目（Lactobacillales），在發(fā)酵第4天時還出現(xiàn)了梭菌目（Clostridiales）、醋酸桿菌目（Acetobacterales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）；在科水平上，海棠酵素發(fā)酵0～4 d，主要為乳酸菌科（Lactobacillaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae），發(fā)酵13～31 d主要為乳酸菌科（Lactobacillaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）；在屬水平上，海棠酵素發(fā)酵0～4 d主要為乳桿菌屬（Lactorbacillus）、酒球菌屬（Oenococcus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和醋桿菌屬（Acetobater），發(fā)酵13～31 d主要為乳桿菌屬（Lactorbacillus）、酒球菌屬（Oenococcus）。乳桿菌屬是有益于宿主健康的微生物，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，能維護人體健康和調(diào)節(jié)免疫功能[20]，酒球菌屬被廣泛應用于釀酒生產(chǎn)中，降低酒的酸度[21]。對海棠酵素進行傳統(tǒng)微生物法分離鑒定時也鑒定出海棠酵素含有乳桿菌屬中的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌以及醋桿菌屬中的熱帶醋桿菌和羅旺醋酸桿菌，與16S rDNA高通量測序結(jié)果相符，說明海棠酵素發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌主要是乳桿菌屬和醋桿菌屬。

圖2 基于門（a）、綱（b）、目（c）、科（d）及屬（e）水平海棠酵素發(fā)酵過程中細菌的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria during Malus spectabilis Jiaosu fermentation based on phylum (a), class (b), order (c), family (d) and genus (e) levels

海棠酵素發(fā)酵過程中（0～31 d）真菌菌群的組成見圖3。由圖3可知，在門水平上，海棠酵素發(fā)酵0 d時包含子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota），在發(fā)酵4 d后主要為子囊菌門；在綱水平上，海棠酵素發(fā)酵0 d時含有酵母綱（Saccharomycetes）和蟲囊菌綱（Eurotiomycetes），發(fā)酵4 d后主要為酵母綱（Saccharomycetes）；在目水平上，海棠酵素發(fā)酵0 d時，包含酵母目（Saccharomycetes）、毛霉目（Mucorales）和散囊菌目（Eurotiales），在發(fā)酵4 d后海棠酵素主要含有酵母目（Saccha romycetes）；在科水平上，海棠酵素發(fā)酵0 d時，包含酵母科（Saccharomycetaceae）、畢赤酵母科（Pichiaceae）和毛霉科（Mucoraceae），在發(fā)酵4 d后主要為酵母科（Saccharomycetaceae）；在屬水平上，海棠酵素在發(fā)酵0 d時，主要為酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）和毛霉菌屬（Mucor），在發(fā)酵4 d后主要為酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida）。酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值，含有較多的蛋白質(zhì)，B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些功能活性物質(zhì)[22]。對海棠酵素進行傳統(tǒng)微生物法分離鑒定時也鑒定出海棠酵素含有紅酵母屬的粘紅酵母、假絲酵母屬的假絲酵母和畢赤酵母屬的畢赤酵母，與2.2中5.8 ITS高通量測序結(jié)果相符。結(jié)果也表明，海棠酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌主要是酵母菌屬和假絲酵母菌屬。

圖3 基于門（a）、綱（b）、目（c）、科（d）及屬（e）水平海棠酵素發(fā)酵過程中真菌的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of fungi during Malus spectabilis Jiaosu fermentation based on phylum (a), class (b), order (c), family (d) and genus (e) levels

2.3.3 海棠酵素發(fā)酵過程中微生物菌相a多樣性分析

海棠酵素發(fā)酵過程中微生物a多樣性分析結(jié)果見表4。由表4可知，海棠酵素中細菌的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于真菌，表明海棠酵素中細菌豐富度大于真菌；真菌的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于細菌，表明真菌菌群多樣性大于細菌菌群。海棠酵素樣品中細菌及真菌的Coverage指數(shù)均為1，說明樣本中物種被檢測概率較高，測序的結(jié)果能夠真實的反應樣品物種豐度和多樣性。

表4 海棠酵素發(fā)酵過程中細菌和真菌的α多樣性分析Table 4 Analysis of Alpha diversity of bacteria and fungi during Malus spectabilis Jiaosu fermentation

2.4 海棠酵素改善小鼠腸道菌群功能

2.4.1 小鼠糞便細菌微生物豐富度分析

圖4 小鼠糞便樣品中操作分類單元（OTU）的Venn圖Fig. 4 Venn diagram of operational taxonmic unit in fecal samples of mice

2.4.2 小鼠糞便細菌微生物組成

基于科、屬水平，空白組、灌胃前組和實驗組3組小鼠糞便細菌微生物組成見圖5。

圖5 基于科（a）、屬（b）水平小鼠腸道細菌物種的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of bacteria in intestinal flora of mice based on family (a) and genus (b) levels

由圖5可知，實驗組小鼠的糞便在科、屬2個水平上的物種豐富度均要高于空白組。在科水平上，灌胃海棠酵素后實驗組小鼠糞便中增加了丹毒絲菌科（Erysipelothrix）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）和紅蝽桿菌科（Coriobacteriales）。在屬水平上，增加了乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus），減少了枸櫞酸桿菌（Citrobacter）。乳酸桿菌為常見益生菌，對人類腸道健康具有促進作用。

2.4.3 小鼠糞便細菌微生物多樣性分析

通過a多樣性分析，3組小鼠糞便樣品的微生物多樣性結(jié)果見圖6。由圖6可知，空白組、灌胃前組和實驗組的Shannon指數(shù)差別不大，表明三組小鼠的微生物多樣性差異較小。實驗組Chao1指數(shù)高于灌胃前組和空白組，表明實驗組小鼠與灌胃前組、空白組相比微生物的豐富度更高。

圖6 小鼠糞便樣品微生物α多樣性分析結(jié)果Fig. 6 Results of alpha diversity analysis of microorganism in fecal samples of mice

3 結(jié)論

首次對傳統(tǒng)自然發(fā)酵法制備的海棠酵素進行微生物菌相分析及功能研究。海棠酵素主要由乳酸菌[（4.4±0.1）×107CFU/mL]、醋酸菌[（5.4±0.1×108）CFU/mL]和酵母菌[（5.0±0.2）×105CFU/mL]組成，經(jīng)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法分離鑒定得到9株優(yōu)勢菌株，其中4株乳酸菌、2株醋酸菌和3株酵母菌。經(jīng)高通量測序分析可知，海棠酵素在發(fā)酵過程中，發(fā)酵0～4 d，細菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、酒球菌屬（Oenococcus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcaceae）、魏斯氏菌屬（Weissella），發(fā)酵13～31 d，主要為乳桿菌屬、酒球菌屬；發(fā)酵0～31 d，真菌主要為酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida）。經(jīng)a多樣性分析可知，海棠酵素細菌豐富度較高，真菌多樣性較高。動物實驗結(jié)果表明，連續(xù)灌胃小鼠0.4 mL海棠酵素28 d后，與空白組和灌胃前組小鼠糞便相比，實驗組小鼠糞便增加了乳桿菌屬和瘤胃球菌屬，減少了枸櫞酸桿菌屬，具有改善小鼠腸道菌群的能力。