黃精多糖對TNF-α作用的大鼠成骨細(xì)胞增殖、凋亡影響及其機(jī)制研究

劉超 徐飛 吳濤 王子平 趙曉明

1.漢中市三二O一醫(yī)院急診科，陜西 漢中 723000

2.漢中市三二O一醫(yī)院急診科，陜西 漢中 723000

3.略陽縣人民醫(yī)院骨科，陜西 漢中 724300

4.寶雞市中心醫(yī)院骨科，陜西 寶雞 721008

骨質(zhì)疏松癥的主要病理特征為骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)退化，成骨細(xì)胞是一種功能性細(xì)胞并可在骨形成過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究[3]表明中醫(yī)藥治療具有補(bǔ)腎健脾及活血等功能，對骨質(zhì)疏松癥具有一定治療效果。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，黃精多糖(polygonatum sibiricum polysaccharide，PSP)具有抗骨質(zhì)疏松的作用并可有效改善骨微結(jié)構(gòu)。PSP可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[6]。研究報道[7]指出補(bǔ)腎方可能通過上調(diào)微小RNA-212(micro RNA-212，miR-212)表達(dá)進(jìn)而有效治療骨質(zhì)疏松。然而，PSP是否通過上調(diào)miR-212的表達(dá)治療骨質(zhì)疏松尚未可知。因此，本研究通過應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的介質(zhì)，探討黃精多糖是否可通過調(diào)控miR-212表達(dá)從而影響TNF-α誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞增殖及凋亡，以期從分子水平探討黃精多糖防治骨質(zhì)疏松癥的作用，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠成骨細(xì)胞 CP-R091購自武漢普諾賽生命科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司；黃精多糖購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；α-MEM培養(yǎng)基購自南京維森特生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與Realtime PCR SYBR premix均購自日本TaKaRa公司；Trizol試劑與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；miR-212 mimics、miR-212抑制劑(anti-miR-212)及其陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗鼠Cyclin D1、P21、BcL-2、Bax一抗與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；蛋白裂解液與BCA檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；顯色液購自美國BIO-BAD公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1成骨細(xì)胞CP-R091培養(yǎng)及黃精多糖處理：CP-R091細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %FBS的α-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、5 % CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70 %時，使用不同濃度的黃精多糖處理細(xì)胞：5、10、25、50 mg/L[8]，同時將未經(jīng)處理的CP-R091細(xì)胞作為對照即CP-R091組。

1.2.2TNF-α處理及實(shí)驗(yàn)分組：收集黃精多糖處理24 h后的CP-R091細(xì)胞，每組分別加入濃度為30 μg/L的TNF-α進(jìn)行處理48 h[9]，實(shí)驗(yàn)分組分別為CP-R091+TNF-α組、CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L組，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果選取黃精多糖適宜濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)研究中為驗(yàn)證黃精多糖是否可通過調(diào)控miR-212表達(dá)進(jìn)而影響成骨細(xì)胞增殖及凋亡，將miR-212 mimics及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染入CP-R091細(xì)胞(12 h)，并加入TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)48 h，分別為miR-212組、miR-NC組；將anti-miR-212、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染入CP-R091細(xì)胞(12 h)，加入TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)48 h，加入適宜濃度的黃精多糖處理24 h，分別為CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-212組、CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC組，收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖：收集各組對數(shù)生長期CP-R091細(xì)胞，分別于藥物處理或?qū)嶒?yàn)處理24、48、72 h時，向每孔加入20 μL濃度為5×103mg/L的MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，放入搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)15 min，利用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處各孔光密度值(OD)，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集實(shí)驗(yàn)處理后各組CP-R091細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，加入100 μL Binding Buffer制備細(xì)胞懸液，相同離心條件下進(jìn)行離心，加入加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)，充分混勻后加入10 μL碘化丙錠(PI)染色液，室溫下避光孵育15 min，加入400 μL Binding Buffer，每個樣本分別收集1×104個細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-212相對表達(dá)量：采用Trizol法提取各組CP-R091細(xì)胞RNA，應(yīng)用核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度與純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，根據(jù)qRT-PCR反應(yīng)試劑盒配置20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循環(huán)。miR-212以U6為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-212相對表達(dá)量。

1.2.6蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cyclin D1、P21、BcL-2、Bax蛋白表達(dá)：收集各組CP-R091細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取CP-R091細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣本20 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下放入室溫封閉液封閉1 h，TBST清洗3次×5 min，加入一抗(稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次×5 min，加入二抗(稀釋比1∶3 000)，室溫下振蕩孵育1 h，TBST清洗3次×5 min，加入顯色液，置于凝膠成像儀內(nèi)顯影，調(diào)整曝光時間，應(yīng)用Quantityone軟件分析條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖影響

黃精多糖作用TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞CP-R091 48 h后，細(xì)胞增殖檢測結(jié)果為：與CP-R091組比較，CP-R091+TNF-α組CP-R091細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而P21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與CP-R091+TNF-α組比較，CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L組CP-R091細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而P21蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，但CP-R091+TNF-α組與CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L組間比較差異不顯著(P>0.05)，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L組間比較差異不顯著(P>0.05)，因此選取黃精多糖濃度為25 mg/L進(jìn)行后續(xù)研究，見圖1。

2.2 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，同CP-R091組相比，CP-R091+TNF-α組成骨細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，BcL-2蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而Bax蛋白水平明顯上升(P<0.05)；相較于CP-R091+TNF-α組，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組成骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，BcL-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，而Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

2.3 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091中miR-212表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，TNF-α誘導(dǎo)的CP-R091細(xì)胞中miR-212的表達(dá)水平較正常培養(yǎng)的CP-R091細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，而CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組CP-R091細(xì)胞中miR-212的表達(dá)水平與CP-R091+TNF-α組相比顯著升高(P<0.05)，見表3。

2.4 過表達(dá)miR-212表達(dá)對TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091增殖、凋亡的影響

qRT-PCR法檢測CP-R091細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-212 mimics的轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-212組CP-R091細(xì)胞中miR-212的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖4 A。表明成功上調(diào)TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091中miR-212的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，同miR-NC組相比，miR-212組CP-R091細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Cyclin D1、BcL-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而Bax、P21蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖蛋白影響A：黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091存活率的影響；B、C：黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖蛋白表達(dá)的影響。注：與CP-R091組比較，aP<0.05；與CP-R091+TNF-α組比較，bP<0.05；與CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L組比較，cP<0.05；與CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L組比較，dP<0.05；與CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組比較，eP<0.05。Fig.1 Effect of Polygonatum Polysaccharide on the Expression of Proliferating of CP-R091 in Cells Induced by TNF-α

圖2 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡的影響 A、B：黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡的影響；C：黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡蛋白表達(dá)的影響；D：Western blot法檢測BcL-2、Bax蛋白表達(dá)。注：與CP-R091組比較，aP<0.05；與CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組比較，bP<0.05。Fig.2 Effect of Polygonatum Polysaccharide on Apoptosis of CP-R091 Cells induced by TNF-α

圖3 黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091中miR-212表達(dá)的影響注：與CP-R091組比較，aP<0.05；與CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L組比較，bP<0.05。Fig.3 The effect of polygonatum sibiricum polysaccharide on the expression of miR-212 in CP-R091 cells treated with TNF-α

圖4 過表達(dá)miR-212對TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091增殖、凋亡的影響 A：miR-212的表達(dá)；B：過表達(dá)miR-212對TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091存活率的影響；C：過表達(dá)miR-212對TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091凋亡的影響；D、E：過表達(dá)miR-212對TNF-α處理的細(xì)胞CP-R091增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響。注：與miR-NC組比較，aP<0.05。Fig.4 Effect of overexpression of miR-212 expression on proliferation and expression of apoptosis protein in TNF-α-treated cells

2.5 抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖的促進(jìn)作用

黃精多糖是否通過上調(diào)miR-212表達(dá)而發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)結(jié)果顯示，與CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L+anti-miR-NC組相比，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L+anti-miR-2 12組CP-R091細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而P21蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖的影響 A：抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091存活率的影響；B、C：抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091增殖蛋白表達(dá)的影響。注：與CP-R091+TNF-α組比較，aP<0.05；與CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC組比較，bP<0.05。Fig.5 Inhibition of miR-212 can reverse the expression of proliferating of CP-R091 in the cells affected by TNF-α

2.6 抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6)，CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-212組CP-R091細(xì)胞凋亡率較CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而BcL-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

圖6 抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡表達(dá)的影響 A：miR-212的表達(dá)；B：抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡的影響；C、D：抑制miR-212能逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α作用的細(xì)胞CP-R091凋亡蛋白表達(dá)的影響。注：與CP-R091+TNF-α組比較，aP<0.05；與CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC組比較，bP<0.05。Fig.6 Inhibition of miR-212 can reverse the effect of Polygonatum polysaccharides on the apoptosis expression of CP-R091 in cells treated with TNF-α

3 討論

黃精多糖可有效降低血糖血脂且具有抗炎、抗病毒等多種作用功能作用[10]。研究報道[11-12]指出黃精多糖可有效治療動脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病。黃精多糖可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化過程[13-14]。以上研究結(jié)果提示黃精多糖可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的新型藥物。本研究結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖能力明顯降低，而細(xì)胞凋亡能力明顯升高，使用不同劑量的黃精多糖能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，說明黃精多糖可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。P21屬于負(fù)向周期調(diào)控蛋白并可抑制細(xì)胞增殖，Cyclin D1屬于正向周期調(diào)控蛋白并可促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果表明黃精多糖可顯著上調(diào)Cyclin D1表達(dá)及下調(diào)P21表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提示促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖可能是黃精多糖發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的潛在分子機(jī)制。BcL-2家族相關(guān)基因表達(dá)可調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，BcL-2基因是抗凋亡基因并可通過阻止細(xì)胞色素C釋放進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，而Bax是促凋亡基因并可通過激活Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)繼而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，已有研究[16]表明BcL-2過表達(dá)可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示黃精多糖可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。

miR-212可通過抑制靶基因ZNF133表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移[17]。Liu等[18]研究表明miR-212-3p表達(dá)異常與骨關(guān)節(jié)炎等發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中miR-212的表達(dá)水平顯著降低，而使用黃精多糖處理后可明顯上調(diào)miR-212的表達(dá)水平，說明黃精多糖可能通過上調(diào)miR-212表達(dá)而發(fā)揮作用。同時本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中上調(diào)miR-212表達(dá)可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并降低細(xì)胞凋亡水平，Cyclin D1、BcL-2蛋白表達(dá)升高，而Bax、P21蛋白表達(dá)降低，為進(jìn)一步證實(shí)黃精多糖對TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響是否與調(diào)控miR-212表達(dá)有關(guān)，本研究通過抑制miR-212表達(dá)發(fā)現(xiàn)其可明顯逆轉(zhuǎn)黃精多糖對TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖的抑制作用及其對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，并可逆轉(zhuǎn)其對Cyclin D1、BcL-2、Bax、P21蛋白表達(dá)的作用。提示黃精多糖可能通過上調(diào)miR-212表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而減緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展。

綜上所述，黃精多糖可能通過上調(diào)miR-212表達(dá)而明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，其可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而保護(hù)成骨細(xì)胞，為黃精多糖治療骨質(zhì)疏松癥奠定理論基礎(chǔ)。但關(guān)于黃精多糖對TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞相關(guān)信號通路及miR-212下游靶基因的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步探討。