蘭州地區(qū)奶牛臨床型乳房炎主要病原菌分離鑒定及耐藥性分析

趙祎云，隋國燕，唐 峰，李世宏

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 遼寧省畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是由多種病原微生物感染或外傷所引發(fā)的一種綜合征，是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一[1]。奶牛乳房炎可導(dǎo)致產(chǎn)乳量下降、乳蛋白及乳糖含量下降等情況，從而影響乳品質(zhì)量，部分病原菌可以將自身產(chǎn)生的毒素排入到牛乳中，引發(fā)食品安全問題[2]。此外，長期使用抗生素治療奶牛乳房炎，可導(dǎo)致乳品中抗生素殘留超標(biāo)，進(jìn)而引起食用者過敏、正常菌群失調(diào)或細(xì)菌耐藥性[3]。在我國，奶牛乳房炎的感染率高達(dá)70%。據(jù)報(bào)道，奶牛乳房炎導(dǎo)致我國每年30億元經(jīng)濟(jì)損失，損失金額高于發(fā)達(dá)國家[4]。

奶牛乳房炎的致病菌種類繁多是導(dǎo)致該病復(fù)雜性的重要原因之一[5]。目前，人們發(fā)現(xiàn)150多種病原微生物都可引起乳房炎。在我國，鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是乳房炎主要致病菌[6]。但是，不同地區(qū)的養(yǎng)殖場中，引起該病的病原不盡相同[7-8]，這給診療工作帶來壓力。此外，長期的抗生素治療還引起了臨床致病菌耐藥性的發(fā)生，進(jìn)一步增加了乳房炎治療的難度。因此，本試驗(yàn)通過采集2019年春、夏季蘭州某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場患有臨床型乳房炎的病牛奶樣，進(jìn)行主要致病菌的分離鑒定以及藥敏試驗(yàn)，為控制和治療乳房炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取蘭州地區(qū)某大型荷斯坦奶牛繁育基地患有臨床型乳房炎的奶牛作為研究對(duì)象?；疾∪閰^(qū)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等癥狀，且其他方面健康的泌乳期奶牛；乳汁中出現(xiàn)血液、絮狀、凝塊及清水等癥狀的泌乳期奶牛。

1.2 主要試劑 甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、MH瓊脂培養(yǎng)基、BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MCA)、90 mm血瓊脂平板成品培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯(BHI)，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；脫纖維綿羊血，購自廣州鴻泉生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；16S rDNA PCR擴(kuò)增試劑盒、DL-2 000 DNA Marker，均購自大連TaKaRa有限公司；K-B藥敏紙片，購自英國OXOID公司。

1.3 病料采集 2019年5-8月，從蘭州某規(guī)?；伤固鼓膛ｐB(yǎng)殖場采集患有臨床型乳房炎奶牛奶樣共110份。采集樣品前先用溫水清洗整個(gè)乳區(qū)及乳頭，并使用75%乙醇消毒，雙手消毒后棄去前3把奶，將奶樣裝入無菌采樣管中，每管5 mL標(biāo)記編號(hào)和乳區(qū)后放入裝有冰袋的采樣箱中，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室接種。

1.4 方法

1.4.1 主要病原菌分離純化 輕搖混勻樣品后取200 μL乳樣加入2 mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)18～24 h，用無菌接種環(huán)取富集培養(yǎng)物劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂、BETA-SSA瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基[9]，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取典型形態(tài)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，將已經(jīng)純化的細(xì)菌再挑單菌落至BHI培養(yǎng)基，于37 ℃搖床 24 h 擴(kuò)大培養(yǎng)，并加入40%甘油于-80 ℃保存。

1.4.2 16S rDNA擴(kuò)增 將凍存的菌液復(fù)蘇后根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取的DNA作為PCR模板，反應(yīng)體系如下：PCR Premix 12.5 μL，F(xiàn)orword Primer 0.25 μL、Reverse Primer 0.25 μL、16S-free H2O 11 μL、DNA模板1 μL，共25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最終延伸溫度72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，目的片段為550 bp，將PCR產(chǎn)物送至西安擎科生物有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定細(xì)菌種屬。

1.4.3 藥敏試驗(yàn)及耐藥性分析 對(duì)分離到的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌進(jìn)行耐藥性檢測。根據(jù)奶牛乳房炎常用治療藥物，選擇10種抗生素(青霉素G、紅霉素、頭孢噻肟、四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氟苯尼考)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and laboratory standard institute，CLSI)[10]，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 主要病原菌分離純化及16S rDNA鑒定 110份樣品經(jīng)分離培養(yǎng)、純化以及16S rDNA測序，共有89份樣品中分離出病原菌，其中包括大腸桿菌33株，金黃色葡萄球菌15株，鏈球菌23株，除此之外，本次試驗(yàn)還有22株非主要病原菌被分離出，具體細(xì)菌分離鑒定結(jié)果見表1。

2.2 耐藥性分析 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌對(duì)青霉素和阿莫西林均表現(xiàn)出高度耐藥，其次是紅霉素和鏈霉素，而對(duì)慶大霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、卡那霉素的耐藥率均在10%左右，而大腸桿菌和鏈球菌對(duì)于土霉素的耐藥率為21.1%和29%，高于金黃色葡萄球菌的7.3%。3類主要病原菌耐藥檢測結(jié)果見表2。

3 討論

導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原體有多種，主要包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等，但其中90%以上由細(xì)菌引起。引起奶牛乳房炎的細(xì)菌主要分為環(huán)境致病菌和傳染性致病菌2類，環(huán)境致病菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌、棒狀桿菌等；傳染性致病菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等[11]。本試驗(yàn)采集到的110份臨床型乳房炎奶樣品中共有89份樣品檢測出病原菌，病原檢出率為80.9%；混合感染有4份，占所有樣品的3.6%。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該牛場臨床型乳房炎主要病原菌主要為大腸桿菌(35.5%)、金黃色葡萄球菌(16.1%)、無乳鏈球菌(14.0%)、停乳鏈球菌(7.5%)和乳房鏈球菌(3.2%)。其中大腸桿菌占比最高為35.5%，這與王丹等[11]、張莉莉[12]對(duì)蘭州地區(qū)大腸桿菌檢出結(jié)果基本一致。大腸桿菌作為最主要的環(huán)境致病菌之一，其主要是通過墊料、糞便等環(huán)境因素傳播。建議在日常管理方面，應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理，勤換墊料，勤對(duì)牛舍消毒，從源頭減少環(huán)境致病菌的感染。無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌作為傳染性致病菌中最重要的3種，在本次試驗(yàn)中占總分離細(xì)菌的37.6%。本結(jié)果與李宏勝等[13]、羅金印等[14]在蘭州的調(diào)查結(jié)果相比有明顯的改善。傳染性致病菌由于超級(jí)耐藥菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，MRSA)的出現(xiàn)治療十分困難，長期影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，近些年隨著科技的進(jìn)步，帶有自動(dòng)消毒的擠奶設(shè)備的應(yīng)用與規(guī)范的擠奶流程，都能有效改善由傳染性致病菌引起的乳房炎[15]。本試驗(yàn)還分離出除以上3類主要致病菌外的22株病原菌，其中主要為克雷伯菌和沙雷菌等條件致病菌且單種細(xì)菌分離比例均不足細(xì)菌總數(shù)的2%，但在日常生產(chǎn)中仍需加以防范，避免此類細(xì)菌感染而帶來不必要的損失。

表1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Table 1 Results of isolation and identification of bacteria

表2 病原菌耐藥檢測結(jié)果Table 2 Detection results of drug resistance of pathogenic bacteria

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試病原菌對(duì)青霉素G和阿莫西林的耐藥率高達(dá)70%以上，最高達(dá)到94.0%，對(duì)鏈霉素的耐藥率也達(dá)到了75.7%，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致[16-17]。導(dǎo)致這一結(jié)果的主要原因，是由于青霉素和鏈霉素是早期治療奶牛乳房炎最常用的藥物，在長期大量的使用這2種藥物后使這些常見致病菌對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。本試驗(yàn)結(jié)果中，頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、卡那霉素這4種藥物對(duì)受試細(xì)菌的抑制效果極為顯著，均在10%以下。由于近些年來，細(xì)菌的耐藥性逐漸受到人們的重視，獸醫(yī)工作人員在治療奶牛乳房炎時(shí)會(huì)選用敏感藥物，并采用交叉用藥、聯(lián)合用藥等方法。這在一定程度上緩解了病原菌耐藥情況的發(fā)生。因此，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議該奶牛場主要選擇以上4種敏感藥物，并采用交叉用藥、聯(lián)合用藥等方法給藥。

雖然，針對(duì)乳房炎病原菌的疫苗正大量投入研究中，但是由于不同地區(qū)的奶牛乳房炎病原菌種類繁多、危害程度各異，這導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗不能有效的針對(duì)每一種病原菌加以預(yù)防[18]。在此背景下，嚴(yán)格規(guī)范的日常管理和科學(xué)合理的用藥治療仍是防治奶牛乳房炎的重要方法。