2016-2018年吉林省豬圓環(huán)病毒2型流行病學調(diào)查及序列分析

苗麗娟，劉東旭，尹柏雙

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林 吉林 132101 ; 2.預防獸醫(yī)學吉林省重點實驗室，吉林 吉林 132101)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2) 隸屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒之一[1],是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、新生仔豬的先天性震顫(CT)等疾病等相關疾病的主要病原[2]，PCV2可引起免疫抑制，易繼發(fā)其他疾病感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

PCV2包括不同亞型，通過研究得知，PCV2可分為5個基因型，分別為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[3]。試驗表明，病理癥狀的不同，毒株之間的差異比亞型之間的差異更重要。PCV2隱性感染一直存在，本課題組主要進行豬病毒病的分子診斷，對于送檢的疑似PCV2感染的病料或血清進行檢測，陽性病料進行分離培養(yǎng)，本試驗對2016-2018年吉林省PCV2的感染情況進行流行病學調(diào)查，對分離到的2株PCV2進行遺傳進化分析，為該病的防治提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料的收集 收集2016-2018年間送檢至吉林省豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控科技創(chuàng)新中心的血清和組織病料434份。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自康為世紀有限公司；TaqDNA聚合酶(含10×Buffer 25 mmoL/L MgCl2)、 dNTP、pMD18-T、感受態(tài)細胞JM109，均購自寶生物工程(大連)有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙啶(EB)、瓊脂粉，均購自維特杰公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中PCV2保守區(qū)進行全基因組序列，設計了4對引物，引物序列見表1，引物由長春庫美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2 DNA的提取及陽性率檢測 按照Universal Genomic DNA Kit試劑盒說明書操作，從病料組織或血清樣品中提取病毒基因組中DNA，用適量的TE溶解，-20 ℃，保存?zhèn)溆?。應用設計的引物進行PCR的擴增，調(diào)查吉林省PCV2在2016-2018年之間的流行情況，對其日齡分布與季節(jié)分布情況進行分析。

1.3.3 PCV2全基因組的擴增、克隆和測序 應用Oligo6.24軟件設計PCV2的4對引物， 見表1。PCR的反應體系為25 μL，10×Buffer 2.5 μL 、F/R(20 pmol/μL) 1 μL、dNTP(2.5 mmol/μL) 3.5 μL，EXTaq酶0.25 μL、滅菌水 13.75 μL。反應條件為35個循環(huán)，預變性 94 ℃ 5 min以后，進入循環(huán) 94 ℃ 50 s, 56 ℃ 1 min 30 s, 72 ℃ 50 s，最后72 ℃延伸 10 min。0.9% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，將目的基因與pMD-18T載體連接轉(zhuǎn)化，將鑒定后為陽性的菌送長春庫美生物工程有限公司測序。

表1 擴增PCV2全基因序列的引物Table 1 Primer sequences and locations for PCV2 amplification

1.3.4 PCV2全基因組、Rep、Cap和ORF3基因的序列比對分析 采用DNASTAR軟件進行序列拼接，2017年和2018年隨機選取1株分離株，使用MegAlign將PCV2-2017/ PCV2-2018與GenBank中收錄的PCV2的國內(nèi)外參考毒株的全基因組序列、ORF1、ORF2、ORF3基因變異性及同源性進行分析，分析其遺傳進化關系，參考毒株見表2。

2 結果

2.1 PCV2流行病學調(diào)查 對434份樣品進行PCR擴增檢測，檢測結果表明，檢出167份PCV2陽性樣品，在2016-2018年PCV2感染率為38.5%；感染率最高的年份為2018年，為42.6%;感染率最低的年份為2017年,為33.1%；吉林地區(qū)以中部地區(qū)感染最為嚴重；且各個年齡段的豬均可感染PCV2，發(fā)病率以秋冬時間比較高，具體檢測結果如表3、表4、表5、表6所示。

2.2 全基因組序列分析 用DNASTAR軟件將測得的序列進行拼接，結果表明:PCV2-2017 和PCV2-2018毒株序列全長都為1 767 bp。核酸同源性分析表明：PCV2-2017與法國株AF055394同源性最高，可達99.8%，與 PCV2-2018同源性最低，為80.1%；PCV2-2018與法國株AY322001同源性最高達99.8%，與上海株GU124593同源性最低，為77.2%。

表2 進化分析采用的參考毒株Table 2 The reference strain list

表3 2016-2018年吉林地區(qū)PCV2感染情況Table 3 The infection type of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表4 吉林地區(qū)2016-2018年PCV2地區(qū)分布情況Table 4 The region of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表5 吉林地區(qū)2016-2018年PCV2不同日齡分布情況Table 5 The pig of different age groups of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表6 吉林地區(qū)2016-2018年PCV2不同季節(jié)分布情況Table 6 Different seasons distribution of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

用MegAlign分析PCV2-2017和PCV2-2018毒株與GenBank中收錄的其他PCV2毒株的遺傳進化關系，結果見圖1，由圖1可以看出，PCV2毒株可以分為2個分支，PCV2-2017和PCV2-2018處于2個不同的分支中，其中1個分支中PCV2-2018與國內(nèi)GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393及國外AY322001、AB426905毒株親緣關系較近；PCV2-2017與HM102350、JQ809464、GU124593、AF055394、AF055391、GU325757、JX512856組成第2個分支，與法國株AF055394親緣關系最近，同屬于PCV-2b亞型，與JQ809464、HM102350、GU124593親緣關系也較近。

2.3ORF1和ORF3基因序列變化和同源性分析 PCV2-2017 和PCV2-2018毒株中ORF1基因全長都為946 bp,編碼Rep蛋白，在GenBank上核酸和氨基酸同源性分析，結果同源性都為99%，但PCV2-2017在867nt C變?yōu)門，導致丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸。

PCV2-2017和PCV2-2018毒株中ORF3基因長為315 bp,核酸同源性比對結果分別為100%和99%，PCV2-2018在580 nt C變?yōu)門，導致丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸。ORF3編碼的蛋白與病毒在機體內(nèi)的致病性和病毒誘導細胞凋亡有關，該蛋白相對比較保守。

2.4ORF2基因的序列變化和分析 PCV2-2017和PCV2-2018分離株中Cap基因長度為702 bp，編碼Cap蛋白。PCV2-2017毒株在GenBank中進行核酸同源性比對，核苷酸同源性在96%～99%；氨基酸同源性比對，同源性在94%～99%，說明PCV2變異主要發(fā)生在ORF2區(qū)，共有12個點突變，突變主要集中在670～680 nt，有4個位點突變，其余分散于ORF2的其他位置。PCV2-2018毒株在GenBank中進行核酸同源性比對，核苷酸同源性在99%；氨基酸同源性比對，同源性在96%～99%，突變的位點主要集中在670～680 nt，有4個點突變，部分結果如圖2所示。導致相應的氨基酸也發(fā)生改變，這是否導致抗原性發(fā)生改變還需要進一步研究。

圖1 部分PCV2基因組序列構建的遺傳進化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of genome sequence of PCV2 isolated▲： PCV2-2017/ PCV2-2018為本試驗分離株▲: PCV2-2017/PCV2-2018 were isolated for this experiment

圖2 PCV2-2017 /PCV2-2018吉林株ORF 2核酸序列部分比對結果Fig.2 Comparison of PCV2-2017 /PCV2-2018 ORF 2 nucleotide sequences

3 討論

PCV2感染可以引起PMWS等多種疾病的發(fā)生，造成豬體的免疫抑制，繼發(fā)和引起其他疾病的感染和暴發(fā)，目前我國豬群中PCV2、TTSuVs等病原體感染居高不下，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，近年來的研究表明，PCV2與TTSuVs感染造成PMWS的暴發(fā)[4-5]。

本試驗通過對吉林省的2016-2018年部分樣品檢測，結果表明，PCV2的感染在我省普遍存在，感染率為38.5%，其中2017年最低，2018年最高，可能與其他疾病的共感染有關，如腹瀉病的發(fā)生，TTSuVs的共感染有關，需要進一步的研究證實。

本試驗分離到的PCV2，隨機選取2017年和2018年的1株分離株，對全基因組結構進行序列分析。本次獲得PCV2-2017基因組全長1 767 bp,與PCV-2b亞型參考株AF055394親緣關系最近，所以屬于PCV-2b亞型，2003年以前PCV-2a為主要的流行毒株，現(xiàn)在PCV-2b為流行的主要毒株[6-8]。PCV2-2017ORF1經(jīng)過測序拼接后長度為946bp,ORF1編碼Rep蛋白，僅在867nt位置C變?yōu)門，導致272aa變異，由丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸，對其功能是否有影響還需要進一步探究，Rep蛋白與病毒的復制相關，比較保守；ORF3長度為315bp，編碼的蛋白與病毒的致病性有關，能誘導細胞凋亡；ORF2測序拼接后長度為702bp，編碼Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2的主要結構蛋白，與病毒的致病性和抗原表位有關，具有較大的變異性，是刺激機體產(chǎn)生免疫保護應答的重要靶抗原。PCV2-2018與國內(nèi)的福建、上海、浙江株親緣關系比較近，與省內(nèi)2017株相對有一定差異，差異主要集中在ORF2編碼區(qū)，ORF1和ORF3相對保守區(qū)，所以變異不大。