泛素羧基末端水解酶1 基因缺失對(duì)雌性小鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響

吳 比，梁珊珊，阮井玲，黃 鑫，滕曉明，洪 嶺

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院輔助生殖科，上海 200001)

泛素羧基末端水解酶（ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH）是去泛素化家族中的重要成員[1]，其主要功能是將泛素羧基端連接小肽或酯類(lèi)分子水解下來(lái)。UCH-L1具有去泛素化作用、泛素連接酶活性和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)泛素單體的功能，參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑，在神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]、生殖系統(tǒng)[4-5]、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6]，以及腫瘤細(xì)胞增殖[7]過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

已有研究證實(shí)，UCH-L1 參與卵子發(fā)生[5]。在魚(yú)類(lèi)的卵巢組織中，UCH-L1 主要表達(dá)于卵巢的卵黃上；在發(fā)育和滯育的卵黃中UCH-L1 表達(dá)水平較高，而在成熟細(xì)胞的卵黃中幾乎檢測(cè)不到UCH-L1，由此推測(cè)UCH-L1與卵黃的發(fā)生存在密切關(guān)系[8]。UCH-L1 在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中高表達(dá)[5,9]，與卵母細(xì)胞皮質(zhì)和減數(shù)分裂紡錘體相關(guān)聯(lián)[10]。抑制UCH-L1 的作用后，豬卵母細(xì)胞停滯在第1次減數(shù)分裂中-后期過(guò)渡點(diǎn)[11]。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，向小鼠的生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期卵母細(xì)胞中注入U(xiǎn)CH 家族酶活性抑制劑泛素-醛（ubiquitin aldehyde，UBAL）后，引起紡錘體和第一極體發(fā)育異常，導(dǎo)致其減數(shù)分裂停滯在減數(shù)分裂Ⅰ（meiosis Ⅰ, MⅠ）期，提示UCH-L1通過(guò)調(diào)節(jié)皮質(zhì)和減數(shù)分裂期紡錘體來(lái)影響卵母細(xì)胞的成熟[12]。

本研究擬利用現(xiàn)有的UCH-L1 基因缺失小鼠模型，觀察其卵巢功能和卵泡發(fā)育等生殖相關(guān)表型，以期建立一種新的生殖功能障礙小鼠模型，并為研究UCH-L1分子途徑在卵泡發(fā)育中的作用機(jī)制提供必要工具。

1 材料與方法

1.1 UCH-L1 基因缺失小鼠的繁殖、飼養(yǎng)

SPF 級(jí)8 周齡的UCH-L1 基因缺失雜合子（UC H-L1＋/－）小鼠（3♂∶2♀）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所劉曉華實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送[品系名為B6;129P2-UCH-L1tm1Dgen /Mmnc，來(lái)自美國(guó)突變小鼠區(qū)域性資源中心（Mutant Mouse Regional Resource Centers，MMRRC）]。SPF 級(jí)8 周齡野生型（UCH-L1＋/＋）C57BL/6J 雌性小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬）-2018-0006]。所有小鼠都飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[SYXK（滬）-2020-0002]層流架中，分籠飼養(yǎng)，喂食轉(zhuǎn)基因動(dòng)物專(zhuān)用鼠糧[江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，蘇飼證（2019）01008）]，自由飲水，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度為（50 ±10）%，每天14 h 光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。為了保種和獲得UCH-L1 基因缺失純合子（UCH-L1－/－）小鼠，安排3個(gè)合籠：（1）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCH-L1＋/－合籠；（2）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCH-L1＋/＋（野生型）合籠；（3）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCHL1＋/＋合籠。

1.2 UCH-L1 基因缺失子代小鼠的基因型鑒定

幼鼠出生3 周后與母鼠分離，取約0.5 cm尾尖組織，提取小鼠基因組DNA，采用PCR 法鑒定UCH-L1 基因缺失。PCR 引物1 序列為5'-CCTTGCCTCCGTCCTCTATTAAAGC-3'，引物2序列為5'-GGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCT-3'，引物3 序列為5'-CTCTCCCCAGACTTAAGCTGCTTTG-3’。PCR 反應(yīng)的退火溫度為58 ℃。目的基因片段大小分別為447 bp 和213 bp。其中，僅出現(xiàn)1個(gè)大小為213 bp 的條帶（引物1 和3 擴(kuò)增獲得）時(shí)判定為野生型（UCH-L1＋/＋），僅出現(xiàn)1 條大小為447 bp 的條帶（引物2 和3 擴(kuò)增獲得）時(shí)判定為純合型（UCH-L1－/－），出現(xiàn)2 條大小分別為447 bp 和213 bp 的條帶時(shí)判定為雜合型（UCH-L1＋/－）。

1.3 UCH-L1 基因缺失雌性小鼠繁殖性能的檢測(cè)

將得到的雜合型（UCH-L1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）雌性小鼠飼養(yǎng)到12 周，通過(guò)陰道涂片和吉姆薩染色的方法檢測(cè)其發(fā)情周期；之后與性成熟的野生型（UCH-L1＋/＋）雄性小鼠按照1 ∶2 的比例合籠，測(cè)定其繁殖性能。

1.4 蘇木精-伊紅染色觀察卵巢及卵泡形態(tài)

取12 周齡的野生型（UCH-L1＋/＋）、雜合型（UCH-L1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）雌性小鼠各2 只，麻醉過(guò)量致死后收集卵巢組織，進(jìn)行固定、包埋和切片。取卵巢最大縱切面的蠟片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，最后脫水封固。光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢中卵泡的大小、形態(tài)和分類(lèi)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢組織中關(guān)鍵激素受體的表達(dá)

將1.4 節(jié)中獲得的卵巢組織切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)雌激素受體β（estrogen receptorβ，ER-β）、卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）及孕酮受體A（progesterone receptor-A，PR-A）和UCHL1 的蛋白表達(dá)情況，其中一抗包括兔抗FSHR 和LHR 多克隆抗體（稀釋比例均為1∶50）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗ER-β 單克隆抗體（1 ∶150）和兔抗PR-A 單克隆抗體（1∶100）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，兔抗UCHL1多克隆抗體（1∶200）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 或Thermo Fisher Scientific 公司。卵巢組織切片經(jīng)抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，加入一抗，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；PBS 洗3次，加入生物素化二抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物三抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗3次，用DAB 顯色試劑盒顯色，蘇木精對(duì)比染色，脫水和封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢組織中關(guān)鍵蛋白含量

利用美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司的TPER 組織蛋白提取試劑提取小鼠卵巢和子宮組織中總蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取200 μL 組織蛋白樣品，每孔上樣15 μL，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（9% 分離膠，5% 濃縮膠）電泳：80 V 恒壓15～20 min，140 V 恒壓至指示劑到達(dá)凝膠下端。

電泳結(jié)束后，將分離蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上：200 mA 恒定電流3 h。然后用6% 脫脂奶粉封閉液（4% 預(yù)冷）封閉后，加入一抗（抗UCH-L1、FSHR、LHR、ER-β 和PR-A抗體同1.5 節(jié)，稀釋比例分別為1∶1000、1∶400、1∶250、1∶1000 和1∶1000；兔抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，稀釋比例為1∶2000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 緩沖液洗膜6次×10 min后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶4000），室溫?fù)u床上反應(yīng)1 h。TBST 緩沖液洗膜6次后，采用電化學(xué)發(fā)光法顯色，放入成像系統(tǒng)中拍照。

1.7 RNA干擾UCH-L1表達(dá)后檢測(cè)卵母細(xì)胞成熟情況

將12 周齡的C57BL/6J 雌性小鼠分籠飼養(yǎng)，于9∶00 左右注射孕馬血清（購(gòu)自寧波第二激素廠）7.5 U/只。48 h 后麻醉致死小鼠，取出卵巢組織，用注射器刺破卵泡，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。用透明質(zhì)酸酶（美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品）進(jìn)行消化，去除顆粒細(xì)胞，收集GV 期卵母細(xì)胞。根據(jù)GenBank 中UCH-L1 基因序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成UCH-L1 siRNA序列（5'-GGAAGTTAGCCCTAAAGT-3'），同時(shí)合成一段無(wú)意義序列作為陰性對(duì)照。將這2 種序列分別注射入GV 期卵母細(xì)胞，即實(shí)驗(yàn)分為siRNA 干擾組和陰性對(duì)照組，每組各5 只，重復(fù)3次。注射用固定針的外徑為120μm，內(nèi)徑為20μm；注射針孔徑為20μm。注射RNA 質(zhì)量濃度為100 ng/μL。

將注射后的卵母細(xì)胞接種于事先配制好的特定培養(yǎng)液（TCM199 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清、0.05 U/mL FSH、0.05 U/mL LH、1 μg/mL 17β 雌二醇、24.2 mg/L 丙酮酸鈉、10 ng/mL EGF、100 U/mL 青霉素和10 μg/mL 硫酸鏈霉素）中培養(yǎng)24 h，觀察并統(tǒng)計(jì)GV 期卵母細(xì)胞成熟為MⅠ期卵母細(xì)胞的情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCH-L1 基因缺失雜合子小鼠的子代基因型

UCH-L1＋/－小鼠自交獲得8 只仔鼠（編號(hào)為1#～8#），提取DNA 并鑒定小鼠基因型。PCR結(jié)果顯示：4#、5#、6#和8#小鼠在213 bp 處有1個(gè)PCR條帶，提示為UCH-L1＋/＋（野生型）；1#小鼠在447 bp 處有1個(gè)PCR 條帶，提示為UCH-L1－/－（純合型）；2#、3#和7#小鼠在213 bp 和447 bp 處各有1個(gè)PCR 條帶，提示為UC H-L1＋/－（雜合型）（圖1 A）。

2.2 UCH-L1－/－純合型雌性小鼠的體表與子宮形態(tài)

由于屬常染色體顯性遺傳，UCH-L1＋/－小鼠沒(méi)有出現(xiàn)異常表型，而UCH-L1－/－小鼠在出生時(shí)與UCH-L1＋/＋和UCH-L1＋/－小鼠也無(wú)明顯區(qū)別；9 周齡時(shí)，UCH-L1－/－小鼠體質(zhì)量偏低，毛發(fā)粗糙，掉毛現(xiàn)象嚴(yán)重（圖1 B），而且運(yùn)動(dòng)困難，靜止時(shí)不自主顫抖，但其性腺外觀看似正常（圖1C）。取9 周齡的3 種基因型小鼠各1 只，經(jīng)陰道涂片確定其處在發(fā)情間期（需要說(shuō)明的是，純合型小鼠沒(méi)有發(fā)情周期，不能確定其所處的發(fā)情時(shí)期），將小鼠麻醉致死，取子宮組織進(jìn)行觀察；肉眼可見(jiàn)雜合型和野生型小鼠子宮沒(méi)有明顯區(qū)別且體積正常，而純合型小鼠子宮明顯偏細(xì)（圖1 D ）。

2.3 UCH-L1 基因缺失雌性小鼠的繁殖能力

陰道涂片顯示，UCH-L1＋/－雜合型母鼠的發(fā)情周期正常，陰道脫落細(xì)胞呈周期性的變化，能夠清晰地分辨出發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期（圖2A～D）；而UCH-L1－/－純合型母鼠的陰道涂片顯示大量持續(xù)性的白細(xì)胞和少量皺縮的上皮細(xì)胞（圖2 E ～H），無(wú)周期性變化。

圖1 UCH-L1＋/－小鼠自交子代小鼠的基因型檢測(cè)以及UCH-L1 基因缺失雌性小鼠的體表與子宮形態(tài)觀察Figure 1 PCR detection of offspring mouse genotypes after the inbreeding of UCH-L1＋/－ mice, and the observation of body surface and uterus morphology in female mice with UCH-L1 gene deletion

圖2 小鼠陰道涂片檢測(cè)發(fā)情周期Figure 2 Vaginal smear test for estrous cycle of UCH-L1＋/－ and UCH-L1－/－ mice

繁育試驗(yàn)顯示，UCH-L1＋/－雜合型4 只母鼠全部產(chǎn)仔，產(chǎn)仔數(shù)為37 只，平均每窩產(chǎn)仔數(shù)為9.25；而UCH-L1－/－純合型的4只母鼠無(wú)一產(chǎn)仔。

2.4 UCH-L1 基因缺失效果在雌性小鼠生殖系統(tǒng)中的驗(yàn)證

對(duì)3個(gè)基因型（UCH-L1－/－、UCH-L1＋/－和UCH-L1＋/＋）的雌鼠采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)UCH-L1 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：UCH-L1－/－雌鼠卵巢和子宮中完全沒(méi)有表達(dá)UCH-L1；而UCH-L1＋/－和UCH-L1＋/＋雌鼠卵巢中UCH-L1 高表達(dá)，子宮中有少量表達(dá)；其中UCH-L1＋/＋雌性小鼠子宮中的UCH-L1 表達(dá)水平高于UCH-L1＋/－小鼠（圖3）。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（圖4 ）顯示：UCH-L1－/－小鼠卵巢組織中未檢測(cè)到UCH-L1蛋白的陽(yáng)性信號(hào)（圖4A 和B）；在UCH-L1＋/－（圖4C 和D）和UCH-L1＋/＋（圖4E 和F）小鼠卵巢組織中都檢測(cè)出較強(qiáng)的UCH-L1 蛋白陽(yáng)性信號(hào)，而且卵母細(xì)胞中UC H-L1 信號(hào)更明顯，在顆粒細(xì)胞和黃體中也有較高強(qiáng)度的UCH-L1 蛋白信號(hào)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各基因型雌性小鼠卵巢和子宮中UCH-L1 蛋白表達(dá)Figure 3 Western blotting detection of UCH-L1 protein in ovary and uterus of three genotypes of female mice

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各基因型雌性小鼠卵巢組織中UCH-L1 蛋白表達(dá)Figure 4 Immunohistochemical detection of UCH-L1 protein in ovary tissues of three genotypes of female mice

2.5 成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢中生殖關(guān)鍵激素受體的表達(dá)及分布

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢和子宮組織中FSHR、LHR、ER-β 和PR-A表達(dá)水平，結(jié)果顯示：UCH-L1－/－小鼠卵巢中ER-β的表達(dá)水平明顯低于UCH-L1＋/－小鼠（P＝0.012＜0.05），而FSHR、LHR 和PR-A 的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異；在UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠子宮組織中，F(xiàn)SHR、LHR、ER-β 和PR-A的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異（圖5A和B ）。

通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢組織中FSHR、LHR、ER-β 和PR-A 的表達(dá)和分布，結(jié)果如圖6 所示。FSHR 在兩種小鼠卵巢中都有表達(dá)，定位于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，而且卵母細(xì)胞中表達(dá)較豐富；LHR 主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，兩種小鼠都有微量表達(dá)；ER-β也是在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)，卵母細(xì)胞中表達(dá)更豐富；PR-A 在兩種小鼠的卵泡腔和卵母細(xì)胞膜上都有表達(dá)。

2.6 UCH-L1 基因缺失小鼠卵巢及卵泡形態(tài)觀察

對(duì)成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢組織切片進(jìn)行HE 染色后觀察發(fā)現(xiàn)，UCH-L1－/－小鼠的卵巢縱切面明顯小于UCH-L1＋/－小鼠的卵巢縱切面，表明UCH-L1 缺失純合型小鼠的卵巢體積明顯小于雜合型小鼠。另外，UCH-L1－/－小鼠卵巢皮質(zhì)層存在一些原始卵泡或閉鎖卵泡，沒(méi)有觀察到有腔卵泡和黃體（圖5A～F）；而UCH-L1＋/－小鼠卵巢存在多個(gè)有腔成熟卵泡（圖5G～H）。

圖5 UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢和子宮組織中關(guān)鍵受體蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Figure 5 Western blotting detection of key receptor proteins in ovarian tissues of UCH-L1－/－ and UCH-L1＋/－ mice

2.7 UCH-L1下調(diào)對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響

通過(guò)RNA干擾的方法下調(diào)C57BL/6雌性小鼠GV 期卵母細(xì)胞中UCH-L1 的表達(dá)后，探索UCHL 1 對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。結(jié)果表明，下調(diào)UCH-L1表達(dá)能顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率（P＝0.023，圖8A 和B）。

圖7 UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢切片的蘇木精-伊紅染色Figure 7 Hematoxylin-eosin staining of UCH-L1－/－and UCH-L1＋/－ mouse ovarian sections

圖8 RNA 干擾UCH-L1 表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響Figure 8 Effect of UCH-L1 knockdown by RNA interference on the rate of oocyte maturation

3 討論

UCH-L1 是一種重要的去泛素化酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，而且在精子生成、卵子發(fā)育和受精等過(guò)程中發(fā)揮作用[11,13]。UCH-L1 基因缺失小鼠被成功引進(jìn)后，嚴(yán)格按照SPF 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律可知：雌性雜合子和雄性雜合子進(jìn)行交配繁殖，其子代會(huì)出現(xiàn)3 種基因型：野生型（UCH-L1＋/＋）、雜合型（UCHL1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）[14]。本研究中基因型鑒定結(jié)果符合預(yù)期，即得到了UCH-L1基因完全缺失的純合型雌性子代小鼠。文獻(xiàn)顯示UCH-L1 缺失影響生殖功能[15-17]。本研究中，將純合型小鼠作為UCH-L1 缺失實(shí)驗(yàn)組，而雜合型小鼠作為對(duì)照組；初步鑒定顯示，該基因缺失（靶向敲除了正常小鼠UCH-L1 基因中第6～8個(gè)外顯子及第9個(gè)外顯子的前6個(gè)堿基）雜合型小鼠的表型完全正常；純合型小鼠則表現(xiàn)出協(xié)調(diào)能力受損、體質(zhì)量偏低、毛發(fā)粗糙及脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重，且運(yùn)動(dòng)困難，靜止時(shí)不自主顫抖，雖然其性腺外觀正常，但解剖發(fā)現(xiàn)子宮和卵巢都發(fā)育不良，子宮偏細(xì)，卵巢體積明顯小于野生型小鼠卵巢體積。

本研究還發(fā)現(xiàn)，UCH-L1 缺失雌性小鼠不具備發(fā)情周期。利用陰道涂片法可以觀察小鼠發(fā)情周期各階段的陰道內(nèi)部細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。由于陰道上皮細(xì)胞種類(lèi)是隨著小鼠排卵周期而變化的，由此推斷UCH-L1缺失雌性小鼠可能沒(méi)有排卵活動(dòng)，間接說(shuō)明其卵巢功能發(fā)育不完善。繁殖實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明該小鼠不具備生育后代的能力。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，純合型缺失小鼠的卵巢皮質(zhì)層僅存在一些原始卵泡或閉鎖卵泡，沒(méi)有腔卵泡和黃體，說(shuō)明沒(méi)有成熟卵泡形成和排卵活動(dòng)（圖5）。同時(shí)，通過(guò)RNA 干擾的方法敲降GV 卵母細(xì)胞中UCH-L1 的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)UCH-L1 表達(dá)下調(diào)能顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率，說(shuō)明UCH-L1 參與了卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程。有研究證明，在GV 和M Ⅱ期卵母細(xì)胞中能夠檢測(cè)到較多的UCH-L1 mRNA，與卵母細(xì)胞皮層相關(guān)；而給GV期卵母細(xì)胞微量注射UCH 家族酶抑制劑后，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂被阻滯在MⅠ期，導(dǎo)致極體異常[12]。因此，當(dāng)純合型缺失小鼠卵巢中沒(méi)有UCH-L1 表達(dá)時(shí)，卵泡的發(fā)生和發(fā)育受到影響，卵巢中不能形成成熟卵母細(xì)胞，取而代之的是出現(xiàn)大量原始卵泡和初級(jí)卵泡。

進(jìn)一步的蛋白質(zhì)印跡法和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在純合型和雜合型小鼠的卵巢和子宮中，與卵母細(xì)胞成熟和排卵相關(guān)的關(guān)鍵受體FSHR、LHR、ER-β 和PR-A 的定位和表達(dá)沒(méi)有明顯差異。值得注意的是，UCH-L1＋/－雜合型小鼠卵巢中ER-β 表達(dá)量明顯高于純合型小鼠。

在生殖系統(tǒng)中主要存在兩種雌激素受體：ER-α和ER-β。關(guān)于ER在卵巢及卵母細(xì)胞發(fā)育中的作用，目前研究主要集中在ER-β[18-19]。ER-β主要存在于生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞中[18]，也可在一些間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[20]。ER-β 表達(dá)在卵泡發(fā)育的不同時(shí)期呈現(xiàn)階段性特異性表達(dá)，在原始卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)量較少，在竇腔形成初期的卵泡中表達(dá)增加，在竇腔高度發(fā)展階段的卵泡中表達(dá)量最多。已知雌激素主要來(lái)源于卵泡顆粒細(xì)胞，雌激素和FSH 協(xié)同作用，刺激顆粒細(xì)胞有絲分裂和卵泡腔形成，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和優(yōu)勢(shì)卵泡排出[21]。由此推測(cè)，UCH-L1 基因缺失雌性小鼠卵巢中沒(méi)有UCH-L1蛋白的表達(dá)，造成ER-β表達(dá)量降低，進(jìn)而發(fā)生排卵障礙。這與之前的發(fā)情周期觀察和卵巢切片HE 染色結(jié)果相互印證，都說(shuō)明UCH-L1 缺失雌性小鼠的生殖功能存在障礙。但是，UCH-L1 缺失是怎樣造成ER-β 降低的，還需要進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，UCH-L1 缺失純合型雌性小鼠不具備形成成熟卵泡及排卵的能力，卵巢中ER-β 表達(dá)量顯著降低，推測(cè)UCH-L1有可能通過(guò)下調(diào)卵巢中ER-β 的表達(dá)，影響卵母細(xì)胞成熟及排卵過(guò)程。