基于RNA-Seq 技術(shù)的犏牛囊胚冷凍前后單核苷酸多態(tài)性和可變剪切分析

鄭 杰, 張國忠, 胡艷梅, 伍學(xué)一, 楊宗富, 字向東

(1. 攀枝花市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心, 攀枝花 617000;2. 西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041)

隨著人類輔助生殖技術(shù)的飛速發(fā)展，胚胎超低溫保存已成為體外受精(in vitrofertilization，IVF)臨床治療中廣泛應(yīng)用的方法[1]。同時，胚胎超低溫保存技術(shù)在女性生育力保存、供卵、降低多胎妊娠和卵巢刺激的風(fēng)險等方面具有重要意義，是目前唯一被美國生殖醫(yī)學(xué)會認(rèn)可的臨床開展生育力保存的方法[2-3]。玻璃化冷凍法(vitrification)因具有冷凍效率高、操作簡便、能有效避免冰晶的形成等優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣泛、冷凍效率最高的胚胎超低溫保存方法[4]。然而即便選用玻璃化冷凍法對胚胎進(jìn)行超低溫冷凍，胚胎也會不可避免地遭受一定程度的冷凍損傷[1]。Zheng 等[5]研究了571個冷凍囊胚移植周期后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)兩次冷凍后的囊胚相比新鮮囊胚，移植后的流產(chǎn)率較高，二者存在顯著差異。另外還有研究表明，玻璃化冷凍會在一定程度上影響生物細(xì)胞增殖、分化和凋亡等相關(guān)基因表達(dá)，從而間接影響胚胎的發(fā)育能力[4-6]。目前，臨床上一般都用胚胎發(fā)育情況、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等指標(biāo)評估凍融胚胎質(zhì)量，但不能從分子水平上對胚胎進(jìn)行評估，不能有效地闡述胚胎的冷凍損傷機(jī)制。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)指在DNA 或RNA 水平上，等位基因發(fā)生突變而引起DNA序列多態(tài)性的現(xiàn)象，包括顛換、置換、缺失和插入。SNP 是轉(zhuǎn)錄組中十分常見的變異類型，其特點(diǎn)是數(shù)量多、分布廣、可穩(wěn)定遺傳[7]?？勺兗羟?alternative splicing, AS)則是指采用不同剪切方式使得mR N A 前體產(chǎn)生多種mRNA剪切異構(gòu)體的過程。AS普遍存在于真核生物中，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)多樣性的重要作用，人類AS 的基因已達(dá)到總基因的95%[8]。對SNP和AS的研究能使人們更便捷、準(zhǔn)確地從分子水平來探究凍融囊胚的損傷機(jī)制。近年來，RNA轉(zhuǎn)錄組測序(RNA transcriptome sequencing，RNASeq)技術(shù)快速發(fā)展，除了可以準(zhǔn)確分析基因的表達(dá)水平外，還可用于發(fā)掘相關(guān)的功能基因，預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本，以及分析基因的SNP 和AS 等[9]。

哺乳動物如牛、羊、豬等的胚胎形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)和功能與人類胚胎相似，哺乳動物胚胎的研究結(jié)果能對人類胚胎研究提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。目前，研究者已成功利用RNA-Seq技術(shù)在牦牛和犏牛胚胎發(fā)育調(diào)控[10-11]，以及牦牛和犏牛胚胎冷凍損傷[12-13]方面做了初步研究，結(jié)果提示新鮮胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后SNP和AS發(fā)生了相應(yīng)變化，但這些研究并未對冷凍前后的SNP和AS 進(jìn)行比較分析。因此，本研究選用牦牛卵母細(xì)胞和娟姍牛精子進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)，再對雜交二代犏牛囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)，利用RNA-Seq技術(shù)對玻璃化冷凍前后犏牛囊胚SNP的數(shù)目和分布特征，以及AS 的數(shù)目、事件類型和重要差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)進(jìn)行比較分析，以期為后續(xù)人類胚胎冷凍前后相關(guān)基因功能分析和挖掘提供有效數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，為完善人類胚胎的玻璃化冷凍技術(shù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢與凍精來源 牦牛卵巢來源于四川省廣漢市向陽屠宰場，娟姍牛冷凍精子購自四川省家畜改良站。

1.1.2 試劑 促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)(Folltropin?-V)和促黃體素(luteinizing hormone, LH)(Lutropin?-V)均購自加拿大Bioniche公司；青霉素-鏈霉素雙抗和胎牛血清均購自美國Gibco 公司；雌二醇(β-estradiol)、動物細(xì)胞培養(yǎng)液Medium 199(10×)和丙酮酸鈉均購自美國Sigma 公司；透明質(zhì)酸酶(HYASE，10×)、洗精液(SpermRinseTM)、洗精受精液(G-IVFTMPLUS)、卵裂胚培養(yǎng)液(G-1TMPLUS)和囊胚培養(yǎng)液(G-2TMPLUS)均購自瑞士Vitrolife 公司；玻璃化冷凍試劑盒(V T 101)和玻璃化解凍試劑盒(VT102)為日本Kitazato 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 犏牛囊胚的體外生產(chǎn) 將屠宰場采集的牦牛卵巢放于35 ℃盛有DPBS緩沖液的恒溫保溫壺內(nèi)，確保壺內(nèi)溫度恒定，2 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。挑選直徑為3～8 mm 的卵泡，抽取其卵泡液，挑選外周至少被3 層顆粒細(xì)胞包裹且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞，置于38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使牦牛卵母細(xì)胞體外成熟(in vitromaturation, IVM)[14]。

選取質(zhì)量好的成熟卵母細(xì)胞，以20 枚/滴的量轉(zhuǎn)入G-IVFTM微滴中，然后加入已獲能的娟姍牛精子，置于38.5 ℃、含5% CO2和90% N2且飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)22～24 h 以完成IVF。用0.2%透明質(zhì)酸酶去除受精卵上的顆粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至G-1TM微滴并置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，最后轉(zhuǎn)移至G-2TM微滴并置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，得到犏牛囊胚。

1.2.2 樣品的收集 選取經(jīng)IVF 發(fā)育良好且未孵化的3 枚犏牛新鮮囊胚作為新鮮組，使用玻璃化冷凍試劑盒對其余犏牛新鮮囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍操作。將囊胚在液氮中儲存3 d 后，再使用玻璃化解凍試劑盒解凍囊胚，選取解凍后完全復(fù)蘇、未孵化的3 枚犏牛凍融囊胚作為凍融組。用PBS緩沖液清洗兩組囊胚，再分別移至內(nèi)含細(xì)胞裂解液的兩個單細(xì)胞采集管中，超低溫保存。

1.2.3 文庫的構(gòu)建及測序 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，采用TRIzol 法[15]分別提取新鮮組和凍融組犏牛囊胚的總RNA，然后由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司采用Smart-Seq2 方法[16]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的分布情況，判定其質(zhì)量，以20 ng cDNA 為模板進(jìn)行后續(xù)文庫的構(gòu)建。用Bioruptor超聲系統(tǒng)(比利時Diagenode公司產(chǎn)品)將cDNA打斷成200 bp 左右的小片段，然后進(jìn)行cDNA 末端修復(fù)、加堿基A、測序接頭拼接等后續(xù)步驟。選取接頭產(chǎn)物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用CWBIO 凝膠回收試劑盒回收DNA，完成最終文庫的構(gòu)建。最后在HiSeqTM2500 測序平臺上運(yùn)行雙端測序程序(PE100)，對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩個文庫進(jìn)行高通量測序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)檢、成簇與測序，運(yùn)用CASAVA軟件[17]對Illumina測序所得的原始數(shù)據(jù)圖像進(jìn)行分析，得到原始序列數(shù)據(jù)，即Raw Reads。為保證信息分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，需要對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列數(shù)據(jù)過濾步驟，最終得到Clean Reads，再進(jìn)行后續(xù)分析。采用測序飽和度分析和測序隨機(jī)性分析，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估。運(yùn)用TopHat 軟件[18]將測序過濾后得到的Clean Reads 與牦牛參考基因組(BosGru-v2.0)[19]進(jìn)行比對分析。采用DEGseq v1.18.0 軟件[20]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，界定犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚二者文庫間的DEGs。將DEGs 向GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)各個條目進(jìn)行映射，以校正后P＜0.05 為閾值，找出DEGs 中顯著富集的GO 條目。然后通過與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分析DEG s 涉及的信號通路(Pathways)。采用SAMtools-0.1.19[21]和ASprofile v1.0.4 軟件[22]分別對兩樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP 和AS 分析。

1.2.5 測序結(jié)果的實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用實(shí)時熒光定量PCR方法驗(yàn)證基因的表達(dá)情況，其中隨機(jī)選取4個DEGs，并以H2A 作為內(nèi)參基因。用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列和產(chǎn)物長度如表1所示。PCR 總反應(yīng)體系為10 μL，包括上下游引物各0.8 μL、cDNA 模板0.5 μL、ddH2O 2.9 μL和Sso AdvancedTMSYBR?Green Super mix 5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：首先95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，并4 ℃保存。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物信息Table 1 Primers for real-time fluorescence quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 測序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

新鮮囊胚組和凍融囊胚組分別獲得52641524條和56521104 條Raw Reads，過濾后分別獲得51099116 條和54192358 條Clean Reads，分別占Raw Reads 的97.07%和95.88%。Q30 可用于反映測序的堿基質(zhì)量水平，質(zhì)量值(Q)越高代表堿基被測錯的概率越小。本次新鮮囊胚組和凍融囊胚組測序的Q30 百分比分別為92.02%和91.91%，表明此次測序質(zhì)量水平高，文庫構(gòu)建完整，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 測序飽和度分析和隨機(jī)性分析

如圖1A 和圖1B 所示，將數(shù)據(jù)按照10%、20%......100%比例進(jìn)行測序，并統(tǒng)計(jì)在每個測序數(shù)據(jù)量下獲得的基因的表達(dá)量。根據(jù)基因的表達(dá)量不同，將基因分為4個等級，統(tǒng)計(jì)不同數(shù)據(jù)量下基因定量的準(zhǔn)確性。橫坐標(biāo)為不同深度的數(shù)據(jù)量，縱坐標(biāo)為在該深度下準(zhǔn)確估計(jì)表達(dá)量的基因百分比。犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本檢測到的基因數(shù)隨著測序數(shù)據(jù)量的增多而升高，當(dāng)測序量比例達(dá)到30%時，可明顯看出測序數(shù)據(jù)量已達(dá)平臺期，增長速度已基本趨于平緩，表明在此時檢測到的基因數(shù)已基本達(dá)到飽和值，兩樣本的測序量已經(jīng)基本覆蓋到細(xì)胞中表達(dá)的全部基因，測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

測序結(jié)果隨機(jī)性(均一性)則是通過檢測統(tǒng)計(jì)每個基因在不同位置的深度來衡量確定的。因?yàn)榛蜷L度各不相同，所以將基因外顯子區(qū)域平均劃分成100個窗口，統(tǒng)計(jì)所有基因在該窗口的深度平均值。如圖1C 和圖1D 所示，兩樣本的打斷隨機(jī)性(即均一性)良好，Reads在基因各等分的分布較為均勻，不偏向于基因的特定區(qū)域，說明數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 測序飽和度(A 和B)和隨機(jī)性(C 和D)分析Figure 1 Sequencing saturation (A and B) and randomness (C and D) analysis

2.3 測序結(jié)果比對分析

運(yùn)用TopHat軟件將犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本的Clean Reads 與牦牛參考基因組的Reads 進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其匹配總數(shù)比例分別為80.00%和80.19%，說明該樣品無外源物種污染。

2.4 DEGs 的GO 功能分析

GO 注釋分類后顯示，犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚中共有10532個DEGs，被歸類于23個生物過程(biological process，BP)、22個細(xì)胞組成(cellular component，CC)和22個分子功能(molecular function，MF)為主的3個GO 分類條目中(圖2)。在BP 分類中，細(xì)胞過程類別的富集最顯著；在CC 分類中，細(xì)胞組成類別的富集最顯著；在MF 分類中，整合類別的富集最顯著。

2.5 DEGs的KEGG通路分析

對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚的DEGs 進(jìn)行KEGG 信號通路分析，結(jié)果表明，共有12315個DEGs 注釋到318條信號通路。顯著富集的前5條通路(Top 5 pathways)如表2 所示，其中剪接體通路的富集程度最高，且犏牛凍融囊胚相比新鮮囊胚的大部分DEGs 表達(dá)水平上調(diào)。

2.6 基因變異分析

采用SAMtools-0.1.19軟件進(jìn)行基因變異檢測結(jié)果分析，結(jié)果顯示，犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本分別檢測到116681 和224750個SNP 位點(diǎn)，6668 和10729個插入/缺失(InDel)位點(diǎn)，總變異個數(shù)為123349 和235479個。犏牛凍融囊胚樣本中SNP位點(diǎn)數(shù)和InDel位點(diǎn)數(shù)均明顯多于新鮮囊胚樣本。

圖2 差異表達(dá)基因(DEGs)的GO 功能分類Figure 2 GO functional classifications of differentially expressed genes (DEGs)

表2 差異表達(dá)基因(DEGs)富集前5 位的KEGG 通路Table 2 Top 5 of enriched KEGG pathways of differentially expressed genes (DEGs)

根據(jù)堿基替換方式不同，SNP位點(diǎn)可分為轉(zhuǎn)換型(transition)和顛換型(transversion)。根據(jù)犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本檢測到的SNP 位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)每個突變類型的頻率(圖3)。在新鮮囊胚樣本中，發(fā)生頻率最高的是轉(zhuǎn)換型SNP(A/G、C/T)位點(diǎn)，約占總位點(diǎn)數(shù)的72%，而顛換型SNP(A/C、A/T、C/G、G/T)位點(diǎn)約占28%，轉(zhuǎn)換和顛換的比例(Ts/Tv)為2.57。在凍融囊胚中，發(fā)生頻率最高的是轉(zhuǎn)換型SNP 位點(diǎn)，約占總位點(diǎn)數(shù)的71%，顛換型SNP 位點(diǎn)約占29%，轉(zhuǎn)換和顛換的比例為2.45。在新鮮囊胚樣本的轉(zhuǎn)換型SNP 中，C/T 類型數(shù)量略多于A/G 類型數(shù)量；但在凍融囊胚樣本中，A/G 類型數(shù)量略多于C/T 類型數(shù)量。兩樣本中C/T 類型與A/G 類型所占比例都無較大差異，且顛換型SNP 中A/T 所占比例最少。

圖3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變頻率分布Figure 3 Mutation frequency of single nucleotide polymorphism (SNP)

2.7 基因的AS 分析

AS 廣泛存在于真核生物中，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制。AS 事件主要分為外顯子跳躍和盒式外顯子跳躍、內(nèi)含子滯留和多重內(nèi)含子滯留、可變5’端或3’端剪切、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可變剪切(alternative splicing of transcription start sites，TSS)、轉(zhuǎn)錄結(jié)束區(qū)域可變剪切(alternative splicing of transcription termination sites，TTS)共5 種類型[22](圖4A)。

圖4 可變剪切事件類型(A)和分析統(tǒng)計(jì)圖(B)Figure 4 The types (A) and analysis statistics (B) of the alternative splicing (AS)

用ASprofile 軟件分析各樣本基因的AS 事件(圖4B)。從犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚中分別檢測出49388 和65241個AS 事件。在兩個樣本檢測到的AS 事件類型中，TSS 是最普遍的類型，新鮮囊胚中TSS 數(shù)量為22962個，占總AS 事件的46.5%；凍融囊胚中TSS 數(shù)量為28652個，占總AS 事件的43.9%。其次是TTS 類型，新鮮囊胚中TTS數(shù)量為22048個，占總AS事件的44.6%；凍融囊胚中TTS 數(shù)量為27196個，占總AS 事件的41.7%。無論從總數(shù)還是各類型來看，犏牛凍融囊胚的AS 事件均多于犏牛新鮮囊胚。

2.8 測序結(jié)果的實(shí)時熒光定量PCR 驗(yàn)證

隨機(jī)選取HSP110、RPL31、REX1 和BAD共4個DEGs，采用實(shí)時熒光定量PCR 方法驗(yàn)證這些基因的表達(dá)情況，并采用Pfaffl 法[23]分析4個基因在兩樣本中的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，實(shí)時熒光定量PCR和RNA-Seq兩種方法計(jì)算得到的差異倍數(shù)基本一致(圖5)。PCR 驗(yàn)證說明此次RNASeq 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖5 實(shí)時熒光定量PCR 驗(yàn)證RNA-Seq 檢測出的差異表達(dá)基因(DEGs)Figure 5 qRT-PCR to verify the differentially expressed genes (DEGs) detected by RNA-Seq

3 討論

本研究采用SAMtools-0.1.19對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本測序數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP 檢測分析，結(jié)果顯示犏牛凍融囊胚樣本中SNP位點(diǎn)數(shù)和InDel位點(diǎn)數(shù)都明顯多于犏牛新鮮囊胚樣本，說明胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后，其基因突變的概率明顯增大。犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本中轉(zhuǎn)換型SNP比例都明顯高于顛換型，Ts/Tv 比值分別為2.57 和2.45。Ts/Tv 理論比值是0.5，而本研究中Ts/Tv比值要遠(yuǎn)大于理論值，這與Kraus 等[24]和Aslam等[25]在其他哺乳動物中的研究結(jié)果相似；這一現(xiàn)象稱之為“轉(zhuǎn)換偏差”。轉(zhuǎn)換偏差這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，可能是因?yàn)槲锓N長期自然進(jìn)化的選擇，有利于保持編碼蛋白原有結(jié)構(gòu)，以減少有害突變形成的概率[26-27]。也有人認(rèn)為，嘌呤和嘧啶的結(jié)構(gòu)和代謝等內(nèi)在特征決定，才導(dǎo)致轉(zhuǎn)換偏差的產(chǎn)生[28]。本研究中，犏牛新鮮囊胚樣本中C/T 類型數(shù)量略多于A/G 類型。這是因?yàn)镈NA 中的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)有較高的頻率突變成胸腺嘧啶(thymine，T)，所以一般在SNP 中C/T類型所占比例最高[29-30]。然而犏牛凍融囊胚樣本中A/G 類型數(shù)量略多于C/T 類型，這與張得芳等[31]利用高通量測序技術(shù)對不同海拔下花葉海棠葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序研究的結(jié)果相似，推測可能是樣本自身GC 含量較高所致。犏牛囊胚經(jīng)冷凍操作后，不管是SNP 和InDel 位點(diǎn)數(shù)明顯增多，還是發(fā)生轉(zhuǎn)換偏差，都提示哺乳動物胚胎經(jīng)超低溫冷凍保存后突變概率明顯增大，為有效降低冷凍程序帶來的損傷，SNP在胚胎玻璃化冷凍過程中起重要的調(diào)控作用。

本研究從犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本中分別檢測出49388 和和65241個AS 事件，說明二者含有大量的AS 基因。此外，犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚發(fā)生AS 的數(shù)量存在差異，表明新鮮囊胚經(jīng)歷胚胎冷凍和復(fù)蘇等外界環(huán)境的變化后，AS 基因的表達(dá)存在特異性。研究表明，除了不同環(huán)境下AS 存在基因特異性外，生物不同發(fā)育時期[32]及不同組織[33]中均可發(fā)現(xiàn)AS 基因特異性。Montelli 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物處于不同發(fā)育時期或在不同組織結(jié)構(gòu)中，AS 能有效調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)物的功能及結(jié)構(gòu)。這些基因的AS 類型非常豐富，目前共鑒別出12 種類型，其中以TSS、TTS、外顯子跳躍和盒式外顯子跳躍、內(nèi)含子滯留和多重內(nèi)含子滯留、可變5’端或3’端剪切類型為主。本研究檢測到的AS 類型中，TSS 比例最高，在犏牛新鮮囊胚中發(fā)生率為46.5%，犏牛凍融囊胚中發(fā)生率為44.6%；其次是TTS，犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚中的發(fā)生率分別為43.9%和41.7%。這與字向東等[10]利用RNA-Seq 技術(shù)對牦牛IVF 胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)錄組的檢測結(jié)果一致。但是，另有學(xué)者通過高通量測序技術(shù)分析犏牛睪丸轉(zhuǎn)錄組時發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子滯留事件發(fā)生率最高(40%)，其次是外顯子跳躍事件(23%)[35]。也有文獻(xiàn)表明，豬[36]和京海雞卵巢[37]中內(nèi)含子滯留事件發(fā)生率最低。有研究者認(rèn)為，內(nèi)含子滯留事件在動物中發(fā)生率低，而在植物中最常見[38]。這些研究表明，在不同生物、不同發(fā)育時期[32]、不同組織[33]間所發(fā)生的AS類型均存在差異性，這可能是由在不同生物、不同組織和不同生長發(fā)育時期真核生物的基因和蛋白質(zhì)數(shù)量差異較大所導(dǎo)致。

對犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本的DEGs進(jìn)行KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，剪接體通路富集程度最高，也進(jìn)一步證明了胚胎經(jīng)超低溫冷凍保存后發(fā)生了大量AS 事件。在剪接體通路中犏牛凍融囊胚上調(diào)表達(dá)最為顯著的DEGs 是以mRNA 前體剪接因子(pre-mRNA processing factor，Prp)4 和Prp19 為代表的大部分mRNA 前體剪接因子。李昂等[39]研究發(fā)現(xiàn)，Prp19 會對HeLa 等細(xì)胞產(chǎn)生不良反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并可能會激活前體RNA剪接體，從而引發(fā)DNA 損傷效應(yīng)[40]。Prp4 可通過影響一些基因的表達(dá)，間接使其內(nèi)含子剪切效率明顯降低，從而可能發(fā)生DNA 突變[41]。而內(nèi)含子剪切效率的降低，還會引起mRNA 降解，降低蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而影響蛋白質(zhì)的功能。所以，從犏牛新鮮囊胚和凍融囊胚兩樣本檢測出大量AS 事件，以及通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)剪接體通路的顯著富集，這些結(jié)果都表明，胚胎經(jīng)超低溫冷凍保存后發(fā)生了大量AS 事件，而一些Prp的上調(diào)可能會對胚胎產(chǎn)生不利影響。

有關(guān)人類胚胎的臨床研究表明，凍融胚胎的發(fā)育情況、臨床妊娠率及活產(chǎn)率與新鮮胚胎相比無明顯差異，甚至更優(yōu)于新鮮胚胎[42-43]。臨床上大多數(shù)是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)判斷凍融胚胎發(fā)育情況是否良好，并在臨床妊娠率、活產(chǎn)率等臨床指標(biāo)上判斷凍融胚胎和新鮮胚胎的差異是否顯著。從臨床指標(biāo)上一般分析認(rèn)為凍融胚胎和新鮮胚胎并未存在顯著差異，但這并不能證明新鮮胚胎經(jīng)超低溫冷凍保存后不會造成一定程度的冷凍損傷。有研究指出，凍融胚胎和新鮮胚胎的臨床妊娠率和活產(chǎn)率無明顯差異，甚至凍融胚胎更優(yōu)于新鮮胚胎，這可能是由于在新鮮周期和過度刺激周期中子宮內(nèi)膜的容受性受損，而并非凍融胚胎質(zhì)量優(yōu)于新鮮胚胎[44]，這也從另一面與本研究相契合，證明胚胎經(jīng)超低溫冷凍保存后，并不會改善新鮮胚胎的質(zhì)量，反而會不可避免地造成一定程度的冷凍損傷。