巨細(xì)胞病毒對(duì)植入聚甲基丙烯酸甲酯小鼠部分免疫指標(biāo)的抑制作用

江 蓉，張齊梅

(1. 四川省阿壩藏族羌族自治州人民醫(yī)院口腔科， 阿壩藏族羌族自治州 624000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科， 瀘州 646000)

科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使得越來越多的醫(yī)用生物材料進(jìn)入了口腔臨床和頜面部修復(fù)的領(lǐng)域。相對(duì)于傳統(tǒng)的金屬或者非金屬陶瓷材料，新型生物材料具有很強(qiáng)的抗沖擊性和抗摩擦性，在使用過程中磨損率也很低[1]。目前高分子材料是各種口腔科生物醫(yī)學(xué)材料的首要選擇[2]。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）具有透明性極好、強(qiáng)度高、耐光老化和質(zhì)輕堅(jiān)韌等優(yōu)良特點(diǎn)。近期的研究發(fā)現(xiàn)PMMA 植入后，其細(xì)胞毒性和對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響均很小，因此被認(rèn)為是牙修復(fù)材料很好的選擇[3-4]。巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是一種常見的機(jī)會(huì)性感染病毒，在人群中感染非常普遍，與口腔潰瘍和急性牙周炎等口腔疾病的發(fā)生緊密相關(guān)[5-7]。然而，CMV感染對(duì)口腔生物材料植入后免疫系統(tǒng)的作用，目前研究還很少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠45 只，4 周齡，體質(zhì)量12～15 g ，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0011]；CMV 購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，將CMV 進(jìn)行10 倍稀釋后定量接種細(xì)胞，按Reed-Muench法計(jì)算病毒致半數(shù)細(xì)胞感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）為105U/0.1 mL；PMMA購(gòu)自上海眾榮新材料科技有限公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD 公司；CD68、CD206、CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25 和Foxp3 抗體均購(gòu)自美國(guó)BD 公司；腫瘤壞死因子-α(TNFα)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek 儀器有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建[8]

本實(shí)驗(yàn)在西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)開展[SYXK(川)2018-213]，設(shè)施達(dá)到ABSL-2 級(jí)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)生物安全要求。小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=30）和病毒感染組（n=15）。病毒感染組于腹腔內(nèi)接種106U/mL 的病毒懸液10 μL，建立CMV 感染小鼠模型，空白對(duì)照組以相同方法注射相同體積的生理鹽水。模型建立7 d 后，在無菌操作下取小鼠尾靜脈血0.1 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（南京建成生物研究所）檢測(cè)CMV IgM 和IgG。CMV IgM、IgG 均陽性者判斷為CMV 感染，即模型建立成功。建模7 d 后，模型組小鼠死亡2 只，造模不成功2 只，空白對(duì)照組30只小鼠和病毒感染組11只小鼠用于后續(xù)研究。

1.3 PMMA的植入

接種病毒后7 d，采用1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的PMMA植入到小鼠背部皮下。小鼠共分為3 組：空白對(duì)照組15 只小鼠進(jìn)行假手術(shù)，作為對(duì)照組；空白對(duì)照組小鼠15 只皮下植入PMMA，作為植入對(duì)照組；病毒感染組小鼠11 只皮下植入PMMA，作為植入CMV 組。植入PMMA 后7 d，對(duì)照組和植入對(duì)照組小鼠分別死亡2只，植入CMV組小鼠死亡1 只。

1.4 單核/巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）的檢測(cè)

小鼠植入PMMA 后7 d，采用1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開胸腔，暴露心臟，用針頭刺入右心室，收集小鼠的心臟血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)分別進(jìn)行單核/巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞亞群及Treg 細(xì)胞的檢測(cè)，三項(xiàng)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的流式抗體分別是C D 68、CD206 和CCR7 抗體，CD3、CD4 和CD8 抗體，以及CD4 和CD25 抗體，均室溫孵育20 min。采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)M1 型單核/ 巨噬細(xì)胞（CD68+CCR7+細(xì)胞）和M2 型單核/巨噬細(xì)胞（CD68+CD206+細(xì)胞）的比例，CD4+T 細(xì)胞（CD3+CD4+細(xì)胞）和CD8+T 細(xì)胞（CD3+CD8+細(xì)胞）的比例，以及Treg 細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞）的比例。

1.5 炎性因子的檢測(cè)

小鼠植入PMMA 后7 d，收集小鼠的心臟血，分離出血漿，ELISA 檢測(cè)TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMV抑制小鼠植入PMMA后的M1型單核/巨噬細(xì)胞比例升高

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，植入對(duì)照組外周血中CD68+CCR7+M1 型單核/巨噬細(xì)胞的比例升高了44.63%（t＝2.794，P＝0.049），CD68+CD206+M2 型單核/巨噬細(xì)胞的比例降低了39.71%（t＝3.806，P＝0.019）；CMV 能夠顯著抑制PMMA引起的M1 型單核/巨噬細(xì)胞比例升高，與植入對(duì)照組比較，植入CMV組外周血中CD68+CCR7+M1 型單核/巨噬細(xì)胞的比例降低了73.18%（t＝5.896，P＝0.004），CD68+CD206+M2 型單核/巨噬細(xì)胞的比例則升高了2.18 倍（t＝7.971，P＝0.001）（圖1）。

2.2 CMV抑制小鼠植入PMMA后CD4+/CD8+T細(xì)胞比值

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組與植入對(duì)照組外周血中CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值沒有明顯差異（t＝1.564，P＝0.193）；CMV 能夠顯著抑制PMMA 植入后CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值，相對(duì)于植入對(duì)照組，植入CMV 組外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值降低了42.91%（t＝6.468，P＝0.003）（圖2）。

圖1 CMV 抑制PMMA 引起的小鼠M1 型單核/巨噬細(xì)胞比例升高Figure 1 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the proportion of M1 monocyte/macrophage ratio in mice

圖2 CMV 抑制PMMA 植入后小鼠CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值Figure 2 Cytomegalovirus (CMV) inhibits the ratio of CD4+/CD8+T cells in mice after PMMA implantation

2.3 CMV促進(jìn)PMMA植入后小鼠Treg細(xì)胞比例升高

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組與植入對(duì)照組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例沒有明顯差異（t＝0.464，P＝0.667）；CMV 能夠顯著促進(jìn)Treg 細(xì)胞比例升高，相對(duì)于植入對(duì)照組，植入CMV 組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例升高了2.49 倍（t＝4.495，P＝0.011）（圖3）。

2.4 CMV抑制PMMA引起小鼠炎性因子含量的升高

ELISA 結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，植入對(duì)照組外周血中TNF-α 和IL-1β 含量分別上升39.56%和46.78%（t＝2.897，P＝0.044 和t＝4.023，P＝0.016）；CMV 能夠抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高，相對(duì)于植入對(duì)照組，植入CMV組外周血中TNF-α 和IL-1β 的含量分別降低了71.65%和57.95%（t＝7.236，P＝0.019 和t＝7.543，P＝0.002）（圖4）。

圖3 CMV 促進(jìn)PMMA 植入后小鼠Treg 細(xì)胞比例升高Figure 3 Cytomegalovirus (CMV) promotes an increase of the proportion of Treg cells in mice after PMMA implantation

圖4 CMV 抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高Figure 4 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the concentration of inflammatory factors in mice

3 討論

目前，有大量的生物材料被應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這些材料在應(yīng)用于臨床前需要經(jīng)過各項(xiàng)生物性能檢測(cè)，很多都具有良好的生物相容性和物理特性[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過50%的人群感染CMV，在免疫力低下的情況下，CMV可引起多種口腔疾病，因此接受口腔植入物的患者至少有一半存在CMV 感染[10]。PMMA 是目前使用最多的高分子材料之一。本研究發(fā)現(xiàn)在正常生理情況下PMMA不會(huì)引起顯著的炎性反應(yīng)，適度的炎性反應(yīng)有利于組織的修復(fù)及清除植入局部的病原微生物；然而在CMV感染的情況下，PMMA植入后CMV會(huì)顯著抑制局部的免疫反應(yīng)，這可能不利于損傷組織的修復(fù)。

單核/ 巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要細(xì)胞，按照其表型可以分為M1 型和M2 型。M1 型單核/巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞，能夠分泌炎性因子或者直接吞噬并清除植入物局部的壞死組織，此外還能啟動(dòng)組織局部的修復(fù)和血管生成。M2 型單核/巨噬細(xì)胞是抑制性細(xì)胞，能夠分泌免疫抑制因子，抑制局部的炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)PPMA 植入后，會(huì)輕微引起M1 型單核/巨噬細(xì)胞升高，降低M2 型單核/巨噬細(xì)胞，這有利于局部壞死組織的清除并抑制病原微生物的增殖[11-13]。然而CMV的感染會(huì)大大降低M1型單核/巨噬細(xì)胞比例，促進(jìn)M2 型單核/巨噬細(xì)胞比例的升高，使得植入物局部成為一個(gè)免疫抑制的微環(huán)境，不利于壞死組織的清除，還可能引起局部感染的加重。

T細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，CMV感染會(huì)引起CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值下降，Treg 細(xì)胞比例升高，使整個(gè)機(jī)體處于免疫抑制的狀態(tài)。Treg 細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫抑制細(xì)胞，能夠通過分泌IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，促進(jìn)病原微生物的逃逸，可能會(huì)引起或者加重機(jī)體的感染[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPMA 植入后，CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值以及Treg 細(xì)胞比例均沒有顯著變化。CMV感染會(huì)顯著降低PPMA植入后CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，而Treg 細(xì)胞比例則會(huì)顯著升高，這使得材料植入局部免疫力十分低下，不利于壞死組織和病原微生物的清除。

本研究結(jié)果提示，CMV能夠顯著抑制PPMA植入后的免疫反應(yīng)，可為CMV 感染患者口腔生物材料植入后的抗病毒治療提供參考依據(jù)。