水貂阿留申病毒VP2 基因TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

閆文卓, 陸濤峰, 周 潔, 趙麗麗, 陳洪巖

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽 550025；3. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203)

隨著醫(yī)藥學(xué)研究的進(jìn)步，水貂作為動(dòng)物模型的應(yīng)用日漸廣泛，水貂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化也已提上日程。有研究表明，應(yīng)用水貂建立嘔吐模型，有助于抗嘔吐機(jī)制研究和新藥篩選[1]。此外，水貂的聽覺很好，可作為動(dòng)物模型測(cè)試視力對(duì)水平方向聲音絕對(duì)定位能力的影響[2]。同時(shí)，水貂模型對(duì)各種亞型的A 型流感病毒(influenza A virus，IAV)易感性均很強(qiáng)，且感染后表現(xiàn)出與人近似的敏感性和臨床癥狀，呼吸道受體分布也與人類相似，因此其在IAV 研究中應(yīng)用廣泛[3-4]。水貂是嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒、新城疫病毒、阿留申病毒、貂圓環(huán)病毒以及腸炎病毒的宿主[5]，要實(shí)現(xiàn)水貂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，就必須對(duì)其攜帶的病原體進(jìn)行控制，因此建立對(duì)水貂易攜帶病原體的病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)方法是非常必要的。

水貂阿留申病(Aleutian mink disease，AD)又稱水貂漿細(xì)胞增多癥(plasmacytosis)，是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，AMDV)感染引起水貂自身免疫系統(tǒng)功能紊亂的慢性、傳染性疾病[6-7]。漸進(jìn)性消瘦、繁殖力下降、血清γ 球蛋白增多、脾臟腫大、腎臟改變(從腫脹和瘀點(diǎn)到萎縮和凹陷)和腸系膜淋巴結(jié)腫大是該病的典型特征。AMDV可通過水平和垂直方式傳播，引起母貂自然流產(chǎn)和仔貂死亡，能明顯影響水貂的繁殖性能和毛皮質(zhì)量[8]，是影響水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大疫病(犬瘟熱、阿留申病和病毒性腸炎)之一[9]。

AMDV又稱肉食動(dòng)物細(xì)小病毒1型(Carnivore amdoparvovirus 1)，屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒亞科(P a r v o v i r i n a e)細(xì)小病毒屬(Amdoparvovirus)[10]，基因組大小約4.8 kb，編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1 和VP2)和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2 和NS3)。其中VP2 蛋白是主要的免疫原性蛋白，在病毒入侵、致病性和宿主選擇方面發(fā)揮重要作用[11]。宿主感染AMDV 后，會(huì)產(chǎn)生明顯的抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancement，ADE)[12]，發(fā)生嚴(yán)重的免疫復(fù)合物疾病和高γ 球蛋白血癥，造成血管炎及肝腎損傷，使感染進(jìn)一步加重。目前，針對(duì)AD 尚無有效的疫苗[13]，也無可以徹底根治的治療方案，只能通過定期檢疫和淘汰AMDV 陽性水貂，逐步凈化動(dòng)物種群，從而達(dá)到最終控制該病的目的[14]。阿留申病毒還可以感染雪貂、狐、貉、臭鼬、浣熊和水獺等動(dòng)物，是實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物雪貂必須排查的病原。

阿留申病診斷方法主要有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。病原學(xué)診斷主要通過組織研磨液接種克蘭德爾貓腎細(xì)胞(CRFK)，培養(yǎng)后電子顯微鏡直接觀察，結(jié)果準(zhǔn)確，適于實(shí)驗(yàn)室診斷。血清學(xué)診斷中，碘凝集試驗(yàn)(IAT)操作簡易，適合群體檢測(cè)，但特異性差，一般僅作為輔助檢測(cè)方法；對(duì)流免疫電泳(CIEP)敏感性、特異性和重復(fù)性尚可，比較適合于動(dòng)物群體定期檢疫等大規(guī)模檢測(cè)，但操作較復(fù)雜；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫復(fù)合物檢測(cè)法(CIC)效率高、結(jié)果可靠，可用于臨床檢測(cè)。血清學(xué)診斷方法在不斷改進(jìn)和豐富，分子生物學(xué)診斷方法也在不斷建立中。然而，任何一種檢測(cè)與診斷方法都是有局限性的，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求及動(dòng)物種群的狀態(tài)，有針對(duì)性地選擇一種或結(jié)合多種方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)AD 及病原的精確診斷、檢測(cè)與防控，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)水貂和雪貂微生物質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)。因此，探索建立靈敏、高效、準(zhǔn)確的AD 診斷與AMDV檢測(cè)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與樣品 水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗(mink enteritis virus，MEV)B 株和水貂犬瘟熱活疫苗(canine distemper virus，CDV)3 株購自吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司。AMDV、犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)株及犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)株由本實(shí)驗(yàn)室保存。水貂臨床樣品(肝和脾)采自山東、河北和黑龍江水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，共417份。

1.1.2 主要儀器和試劑 TransStart ProbeqPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。病毒DNA抽提試劑盒(Viral DNA Kit)和質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit)購自美國Omega 公司。超微量紫外分光光度計(jì)購自德國Implen 公司。熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司。PCR 擴(kuò)增儀購自美國Perkinelmer 公司。其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上AMDVG 株(No. M20036)的VP2 基因保守序列，應(yīng)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物和1 條特異性探針，探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記TAMRA。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為109 bp。引物及探針均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 水貂阿留申病毒(AMDV)VP2 基因引物和探針的序列信息Table 1 Sequence information of primers and probe of Aleutian mink disease virus (AMDV) VP2 gene

1.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 利用拯救AMDV-G株病毒的全基因合成重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品用于熒光定量P C R 方法的建立，A M D V-G 株基因組GenBank號(hào)為M20036，病毒全基因由北京六合華大基因科技有限公司合成，亞克隆到pUC-19 載體，命名為pAMDV-G。提取質(zhì)粒后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)品，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 AMDV VP2 基因引物及探針的設(shè)計(jì)示意圖Figure 1 Schematic diagram of primer and probe design for detecting AMDV VP2

1.2.3 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 將引物和探針分別稀釋到10μmol/L，反應(yīng)體系總體積為20 μL。在1 μL 探針條件下，進(jìn)行TaqMan 熒光定量PCR，根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)及曲線狀況優(yōu)化上下游引物的工作濃度。再以相同濃度重組質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化的上下游引物濃度，對(duì)探針加入量(0.2 μL、0.4 μL、0.8 μL)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳探針工作濃度。

1.2.4 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用質(zhì)粒pAMDV-G 作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10 倍梯度稀釋，即108～102拷貝/μL共7個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒作為模板，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，得到動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)Ct值及起始模板拷貝數(shù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 以10倍梯度稀釋的AMDV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(108～10 拷貝/μL)為模板，運(yùn)用本研究建立的熒光定量PCR 方法進(jìn)行敏感性檢測(cè)。以ddH2O 為模板作為陰性對(duì)照，以Ct＜35且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S型擴(kuò)增曲線的最低濃度作為檢測(cè)的靈敏度指標(biāo)。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 利用病毒基因組提取試劑盒，分別提取MEV、CDV、CPV 和CAV 的基因組核酸，其中CDV 基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，與其他病毒基因組一起，共同應(yīng)用本研究已經(jīng)建立的熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 利用該熒光定量檢測(cè)方法對(duì)108～103拷貝/μL 6個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每種濃度模板重復(fù)檢測(cè)3次，根據(jù)Ct 值計(jì)算批次內(nèi)變異系數(shù)。另外，在3個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行批次間重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)Ct值計(jì)算批次間變異系數(shù)。利用批次內(nèi)和批次間的變異系數(shù)，評(píng)價(jià)所建立方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 臨床樣品檢測(cè) 從山東、河北和黑龍江水貂養(yǎng)殖場(chǎng)共采集417份肝臟或脾臟樣品，加入滅菌PBS(體積比為1∶5)研磨處理后，反復(fù)凍融3次，于4000 r/min 離心20 min，吸取上清液，用病毒核酸提取試劑盒提取待檢樣品中的核酸，應(yīng)用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法進(jìn)行AMDVVP2 基因檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

使用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為280 ng/μL。根據(jù)公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為4.88×1010拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的熒光定量PCR 反應(yīng)體系共20 μL，含有10 μL 2×TransStart Probe qPCR SuperMix、7.8 μL Nuclease-free Water、0.4 μL探針(10μmol/L)、0.4 μL AMDV VP2 基因上游引物(10μmol/L)、0.4 μL AMDV VP2基因下游引物(10μmol/L)和1 μL 質(zhì)粒模板。優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

2.3 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以1×108拷貝/μL為原始DNA量進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)立3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR，獲得擴(kuò)增曲線。以Ct 值為縱坐標(biāo)，不同標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y ＝-3.456x ＋40.488，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.994(圖2)。結(jié)果顯示，熒光定量PCR 在108～102拷貝/mL的稀釋度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMDV VP2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The standard curve of real-time fluorescent quantitative PCR for detecting VP2 gene of AMDV

2.4 熒光定量PCR 檢測(cè)的敏感性和特異性

敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，熒光定量PCR的檢測(cè)下限為102拷貝/μL(圖3)。

運(yùn)用建立的熒光定量PCR 方法對(duì)AMDV、CPV、MEV、CDV和CAV 的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，從擴(kuò)增曲線看，只有AMDV 檢測(cè)出陽性，而對(duì)水貂可能攜帶的其他病原(CPV、MEV、CDV 和CAV)擴(kuò)增的Ct 值均＞36 或無數(shù)值，可判定為陰性。結(jié)果表明，該方法對(duì)AMDV 具有良好的特異性(圖4)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMDV VP2基因敏感性試驗(yàn)Figure 3 Sensitive test of the real-time fluorescent quantitative PCR for detecting VP2 gene of Aleutian mink disease virus (AMDV)

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMDV VP2基因特異性試驗(yàn)Figure 4 Specific test of the real-time fluorescent quantitative PCR for detecting VP2 gene of AMDV

2.5 熒光定量PCR 檢測(cè)AMDV VP2 基因重復(fù)性

運(yùn)用建立的熒光定量PCR 方法，對(duì)6個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示Ct 值變異系數(shù)均小于3%(表2)，表明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。

2.6 臨床樣品的檢測(cè)驗(yàn)證

分別利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)采自山東省、河北省和黑龍江省水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的417份水貂肝臟或脾臟樣品中AMDV VP2 基因進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果的陰陽性數(shù)據(jù)(表3)。結(jié)果顯示，417份樣品的總AMDV 陽性率為81.5%；其中，山東省陽性率為83.5%，河北省陽性率為75.0%，黑龍江省陽性率為89.0%。3個(gè)省份樣品檢測(cè)的平均Ct 值分別為22.77、20.75 和22.27，對(duì)應(yīng)的病毒拷貝數(shù)分別為1.34×105、5.14×105和1.87×105拷貝/μL。數(shù)據(jù)表明，雖然河北省養(yǎng)殖水貂的AMDV 陽性率比山東省和黑龍江省低，但是陽性樣品的病毒載量相對(duì)較高。隨機(jī)挑選7份陽性樣品，將其擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接PMD-18T 載體，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段相吻合(圖5)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)AMDV VP2 基因的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Intra-assay and inter-batch reproducibility test of real-time fluorescent quantitative PCR for detecting VP2 gene of AMDV

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)水貂臨床樣品中AMDV感染結(jié)果Table 3 Detection of AMDV in the mink clinical samples by real-time fluorescent quantitative PCR (n)

圖5 AMDV 感染陽性水貂臨床樣品的VP2 基因測(cè)序結(jié)果Figure 5 Sequencing results of AMDV VP2 gene in the positive sample of mink clinical samples

3 討論

AD是在世界范圍內(nèi)對(duì)水貂整體健康水平影響最嚴(yán)重的疫病，也是對(duì)水貂養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要因素[15]。由于AMDV的致病機(jī)制特殊，目前尚無有效的疫苗應(yīng)用于疫病防控。因此，檢疫淘汰是控制該病的主要途徑[16]。目前，AD 防控工作做得最好的國家是丹麥，該國不僅制定了針對(duì)AMDV的根除計(jì)劃，還將其列入國家立法中。丹麥利用CIEP 血清學(xué)檢測(cè)方法篩查并剔除AMDV血清學(xué)陽性水貂的措施，基本能將陽性AMDV 水貂場(chǎng)控制在5%以下。在中國，隨著水貂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，很多規(guī)模化水貂養(yǎng)殖企業(yè)也逐漸提高了對(duì)AD 防控的重視程度，自覺效仿歐洲國家采用CIEP 方法對(duì)陽性水貂進(jìn)行檢疫和淘汰。但是由于缺乏整體規(guī)劃，再加上水貂私自買賣和調(diào)運(yùn)等因素的影響，除了極少數(shù)控制嚴(yán)格的養(yǎng)殖場(chǎng)外，中國養(yǎng)殖水貂種群的整體AMDV陽性率還較高。同時(shí)，由于CIEP 檢測(cè)方法自身的局限性、AMDV特殊致病機(jī)制和AMDV抗體發(fā)生的特殊性等原因，采用CIEP 方法對(duì)陽性水貂進(jìn)行淘汰在一定程度上只能減緩AMDV的擴(kuò)散速度，很難達(dá)到根除AD 的目的[14]。

為了提高AMDV的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確率，有必要在開展CIEP 檢測(cè)的基礎(chǔ)上，建立AMDV 核酸檢測(cè)方法。隨著熒光定量PCR儀的小型化和普及程度的加大，熒光定量PCR 方法越來越受到青睞，特別是探針法熒光定量PCR，該方法具有優(yōu)于普通PCR 的敏感性，又具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、實(shí)時(shí)、快速和不易造成污染等優(yōu)點(diǎn)，非常值得推廣應(yīng)用[17]。目前，已經(jīng)有研究者建立了針對(duì)AMDV 的PCR 方法[18]、多重PCR[5,19]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[19]和熒光定量PCR 方法[21-22]，由于AMDV 編碼的VP2 蛋白是主要的免疫原性蛋白，在病毒入侵、致病性和宿主選擇方面發(fā)揮重要作用，因此建立針對(duì)VP2 基因的探針法熒光定量PCR 方法非常必要。

本研究在繪制熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，創(chuàng)新性地采用了AMDV-G株全基因組的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，由于所采用標(biāo)準(zhǔn)品與病毒基因組大小一致、性質(zhì)相仿，能夠很好地模擬養(yǎng)殖場(chǎng)野生病毒株檢測(cè)的模板條件，因此具有更高的可信度和準(zhǔn)確性。同時(shí)，本方法所用引物和探針均僅需0.4 μL，大大降低了反應(yīng)成本，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)步驟僅需1 h 即可讀取結(jié)果，能夠顯著縮短檢測(cè)時(shí)間，加快檢測(cè)速度，提高工作效率。

綜上所述，本研究建立了一種重復(fù)性、特異性和敏感性均良好的針對(duì)AMDV 的熒光定量PCR 檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)的靈敏度為102拷貝/μL，且與CPV、CAV、CDV 和MEV 均無明顯交叉反應(yīng)，特異性良好；組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法的組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于3%，重復(fù)性良好；應(yīng)用該方法檢測(cè)417份水貂臨床組織樣品，發(fā)現(xiàn)我國山東省、河北省和黑龍江省養(yǎng)殖水貂的AMDV陽性率為81.5%，3個(gè)省份樣品檢測(cè)的平均Ct 值分別為22.77、20.75 和22.27，對(duì)應(yīng)的病毒拷貝數(shù)分別為1.34×105、5.14×105和1.87×105拷貝/μL；另外發(fā)現(xiàn)，雖然河北省的AMDV陽性率比山東省和黑龍江省偏低，但是河北省陽性樣品的病毒載量相對(duì)較高。以上結(jié)果提示，本研究所建立的熒光定量PCR方法能用于AMDV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)水貂、雪貂的微生物質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。