探討精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常對精子DNA碎片指數(shù)的影響

甄國志 麥福勁 林冰 葉宇 龐穎儀 梁潔珩 梁宇玲

【摘要】 目的 探討精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常對精子DNA碎片指數(shù)（DFI）的影響。方法 400份精液檢查標(biāo)本為研究對象， 按核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率分為<30%組（200例）和≥30%組（200例）。比較兩組的精子數(shù)及DFI。結(jié)果 ≥30%組的大暈環(huán)精子數(shù)（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環(huán)精子數(shù)（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05） ;兩組中暈環(huán)精子數(shù)、小暈環(huán)精子數(shù)比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常對DFI有影響， 可作為評價精子功能的一項有重要意義的參考指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常;精子DNA碎片指數(shù);不育癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.013

Discussion on the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index? ?ZHEN Guo-zhi， MAI Fu-jin， LIN Bing， et al. Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University， Foshan 528300， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index （DFI）. Methods? ?A total of 400 specimens of semen were taken as the research objects， and were divided into <30% group （200 cases） and ≥30% group （200 cases） according to the abnormal rate of nucleoprotein transition. The sperm count and DFI of the two groups were compared. Results? ?The number of spermatozoa with large halos （68.9±11.5） pieces of ≥30% group was less than that of <30% group （78.6±

8.9） pieces， number of spermatozoa with no halos （11.9±8.1） pieces was more than that of <30% group （4.3±8.5） pieces， and DFI （23.5±9.6）% was higher than that of <30% group （13.8±8.7）%， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in number of spermatozoa with medium-sized and small-sized halos between the two groups （P>0.05）. Conclusion? ?Abnormal sperm nucleoprotein transition affects DFI and can be used as an important reference index for evaluating sperm function.

【Key words】 Abnormal sperm nucleoprotein transition; Sperm DNA fragment index; Infertility

男性不育癥是臨床常見的一種生殖疾病， 根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計， 15% 的育齡夫婦存在不育問題， 其中， 男方因素占40%[1]， DFI是目前評估男性精子質(zhì)量及功能的重要指標(biāo)。精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換， 是魚精蛋白與DNA之間的聯(lián)系導(dǎo)致染色質(zhì)形成層疊的結(jié)構(gòu)， 使精子染色體高度濃縮、穩(wěn)定。精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常， 可使精子DNA穩(wěn)定性降低， 增大精子DNA的損傷， 在精子受精后精核不能正常聚解， 影響雌雄原核的融合。目前對精子核蛋白組型異常與精子DNA損傷及精子質(zhì)量之間相關(guān)性的報道較少， 本研究通過選取2017年5月～2019年5月本中心精液檢查的400份標(biāo)本進(jìn)行檢測、分析。通過觀察精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換對DFI的影響， 明確其相關(guān)性?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本生殖中心自2017年5月～

2019年5月的400份精液標(biāo)本， 受檢者平均年齡（28±4.1）歲， 禁欲2～7 d， 手淫方法收集精液標(biāo)本， 按世界衛(wèi)生組織《人類精液與宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》（第5版）行精液常規(guī)參數(shù)檢查， 采用CASA系統(tǒng)（北京偉力新世界科技發(fā)展有限公司， 型號：WL JY-9000）檢測精子。

1. 2 方法

1. 2. 1 精子染色質(zhì)擴散實驗 實驗步驟參考 Halo-sperm 試劑盒說明書。步驟簡述如下： 新鮮精液行常規(guī)檢查后用PBS調(diào)整至精子密度10×106/ml， 取出30 μl加入溶解的低熔點瓊脂糖凝膠30 μl 中， 溫度37℃下混勻， 加20 μl 精子凝膠混合液于預(yù)處理載玻片上， 蓋上22 cm×22 cm 蓋玻片， 4℃冰箱水平放置5 min。

移去蓋玻片， 放入酸性 DNA 變性液中， 室溫孵育7 min。取出玻片浸泡于裂解液中20 min。在蒸餾水中5 min洗去殘余裂解液。 玻片依次放入70%、90%和100% 乙醇中各2 min 脫水。晾干后玻片用瑞氏染色液覆蓋于樣本表面10 min。用自來水沖洗掉染液， 風(fēng)干。 200倍光鏡下觀察， 比較精子核和核周圍暈環(huán)大小， 計算精子DNA 碎片指數(shù)。

1. 2. 2 精子核蛋白組型檢測（苯胺藍(lán)染色法）

1. 2. 2. 1 實驗原理 在精子發(fā)生成熟過程中， 與精子核 DNA 結(jié)合的堿性蛋白發(fā)生組型轉(zhuǎn)換， 富含賴氨酸殘基的組蛋白逐漸被富含精氨酸和胱氨酸殘基的魚精蛋白所替代。 在酸性條件下， 苯胺藍(lán)與賴氨酸殘基結(jié)合生成藍(lán)色化合物， 從而顯示富含賴氨酸殘基蛋白質(zhì)的存在。

1. 2. 2. 2 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換檢測 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換采用苯胺藍(lán)染色法（試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）分析精子核蛋白成熟度， 操作步驟詳見試劑盒說明書。正常參考值為核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率<30%。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較不同精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率間的精子數(shù)及DFI。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

400份精液標(biāo)本按核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率分為<30%組（200例）和≥30%組（200例）?！?0%組的大暈環(huán)精子數(shù)（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環(huán)精子數(shù)（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）;兩組中暈環(huán)精子數(shù)、小暈環(huán)精子數(shù)比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

在精子發(fā)生過程中， 生精細(xì)胞內(nèi)DNA含量發(fā)生著規(guī)律性變化， 富含賴氨酸的組蛋白逐漸被富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白所代替。魚精蛋白與DNA之間的聯(lián)系導(dǎo)致染色質(zhì)形成層疊的結(jié)構(gòu)， 使精子染色體高度濃縮、穩(wěn)定。精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常， 可使精子DNA穩(wěn)定性降低， 增大精子DNA的損傷， 在精子受精后精核不能正常聚解。

研究發(fā)現(xiàn)， DFI與囊胚形成率有關(guān)[2]， 異常的核蛋白可使過量的精源性組蛋白再次被包裝入受精卵染色質(zhì)中， 妨礙卵裂時染色體的行為及胚胎發(fā)育過程中基因的表達(dá)與調(diào)控， 進(jìn)而影響了雌雄原核的融合， 并且導(dǎo)致胚胎不能正常發(fā)育。 Kumar 等[3] 研究指出， DFI>30% 導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損、胚胎質(zhì)量嚴(yán)重下降、患不孕癥的風(fēng)險明顯增加等不良妊娠結(jié)局。這與 Leach等[4]研究結(jié)論一致。

目前精子DNA碎片的檢測被認(rèn)為是一個新的評價精子質(zhì)量和預(yù)測生育能力的指標(biāo)[5]， 但精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與DFI相關(guān)性的研究較少， 本研究通過觀察精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換對DFI的影響， 明確其相關(guān)性。目前臨床上認(rèn)為精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常的正常臨界值是30%， 作者的研究發(fā)現(xiàn)， ≥30%組的大暈環(huán)精子數(shù)（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環(huán)精子數(shù)（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05） ;兩組中暈環(huán)精子數(shù)、小暈環(huán)精子數(shù)比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 通過分析發(fā)現(xiàn)， 精子核DNA完整性與核蛋白成熟度間存在顯著正相關(guān)， 與先前報道一致 [6]。精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異?？赡苁悄行圆挥囊粋€獨立性因素 [7] ， 目前精子DNA損傷與核蛋白組型轉(zhuǎn)換的檢測方法逐漸趨于成熟和完善， 并在臨床上得到了 一定的應(yīng)用， 因此， 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換可作為評價精子質(zhì)量和功能的另一項有重要意義的參考指標(biāo)。并且對胚胎形成及妊娠臨床結(jié)局是一個有效的預(yù)測指標(biāo)。由于病例數(shù)較少， 本研究結(jié)論有待于更大量病例數(shù)， 采取多中心的數(shù)據(jù)及更深入的研究以驗證。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2020-04-02]