三株優(yōu)良促生菌的１６ＳｒＤＮＡ序列初探

李顯剛　姚拓　舒鍵虹　高巍

摘要：百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15、LC20）與白三葉根際中分離出根瘤菌RW183基因組DNA經PCR擴增16S rDNA序列、陽性克隆檢測、質粒提取測序，并與GenBank中已知序列比對，結果表明，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列與多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過99.00%，RW18與勒克氏菌屬中的Leclercia adecarboxylata（HQ242722）核苷酸序列同源性為99.79%，結合各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步鑒定為Klebsiella sp.，將菌株RW18鑒定為Leclercia sp.。

關鍵詞：促生菌;16S rDNA序列;豆科牧草;百脈根;白三葉

中圖分類號：S541;Q785? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）06-0005-03

隨著農牧業(yè)和園林綠化（包括草坪業(yè)）的發(fā)展，以新型肥源替代部分化肥的應用成為生態(tài)農牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢，百脈根和白三葉得到更多、更廣的應用。本研究從生長在貴州黔南地區(qū)的百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15與LC20），白三葉根際中分離出根瘤菌1株（RW18），均具有溶解多種難溶磷源及分泌植物生長激素（IAA）的功能，并對其部分生物學特征了進行了初步研究，采用16S rDNA分子生物學技術，對3菌株的基因序列、系統(tǒng)發(fā)育學和分類地位進行分析，旨在為進一步提高喀斯特地區(qū)土壤中磷素的循環(huán)利用提供基礎，為開發(fā)利用百脈根及白三葉根際溶磷微生物資源及其綠色無公害生產提供促生菌菌種資源。

1? 菌株菌落特征觀察及主要生理生化特征測定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[1]對菌株菌落形態(tài)特征（菌落質地、形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀，透明度、生長速度等）、主要生理生化特征[葡萄糖利用、甘露醇利用、麥芽糖利用、果糖利用、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽試驗、過氧化氫酶試驗、吲哚試驗、二乙酰（V-P）試驗、硫化氫試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、甲基紅（M-R）試驗等]進行試驗和觀察記錄。具體方法見文獻[2]。

1.1? 細菌總DNA提取

將供試菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)活化并檢查純度后，采用寶生物（大連）公司提供的細菌DNA基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA。

1.2? 16S rDNA的PCR擴增

將提取的菌株基因組DNA稀釋至20 ng/μL，并以此濃度的細菌總DNA為模板，擴增16S rDNA。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

正向引物：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR擴增體系為25 μL，以滅菌的ddH20代替模板DNA作為陰性對照，反應體系組成如下：10×buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板1.0 μL（20 ng/μL），Taq DNA Polymeras 0.25 μL，ddH20 17.25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，循環(huán)30次，25 ℃ 2 min。然后將PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3? PCR擴增產物的回收與檢測

PCR擴增產物經凝膠電泳檢測后，利用OMEGA BIO-TEK公司提供的Get Extraction Kit（50）D-2500-01試劑盒進行產物回收，回收產物再次經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4? PCR產物的回收連接轉化

取1.0 μL PCR產物與克隆載體pMD 18-T Vector連接，5 μL連接反應體系中含有pMD 18-T Vector 0.5 μL、Ligation solution 2.5 μL、PCR擴增產物1.0 μL、無菌ddH20 1.0 μL。充分混勻后離心數(shù)秒，將管壁液滴收到管底，16 ℃水浴16～18 h。將連接產物轉化E.coli DH5ɑ感受態(tài)細胞，涂平板，待菌液吸干后，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16 h，隨機挑取白色單菌落至含有Amp 50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200～300 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1 μL菌液為模板進行PCR擴增反應，反應條件同“1.2”，并取1 mL培養(yǎng)物用于質粒抽提，然后進行PCR鑒定。

1.5? 16S rDNA序列測定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株質粒產物送交上海生工進行測序。測序結果用DNAMAN軟件進行序列拼接，測序結果提交GenBank中的Blast數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，經Clustal（1.8）軟件進行多重序列比較后，結合菌株的生理生化特征，用Mega2.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-jioning）構建菌株系統(tǒng)進化樹。

2? 結果與分析

2.1? 菌株的菌落及生理生化特征

試驗對LC15、LC20、RW183菌株進行了生理生化特征初步鑒定。3株菌在LB固體培養(yǎng)基上生長3 d后菌落特征為：菌株LC15菌落大、不規(guī)則，菌落顏色為淡白色，不透明，濕潤，菌落中間凸起，邊緣光滑;菌株LC20菌落大，不規(guī)則，菌落顏色為乳白色，邊緣不整齊、光滑，半透明，濕潤，菌落中間凸起;菌株RW18菌落小，不規(guī)則，菌落邊緣淡白色，中間淡黃色、凸起，菌落濕潤、不透明。

3株菌的主要生理生化特征見表1。由表1可知，菌株LC15及LC20的吲哚試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗及明膠液化試驗結果呈陰性，淀粉水解、檸檬酸鹽利用、過氧化氫酶產氣、二乙酰（V-P）與硫化氫變色及硝酸鹽還原試驗結果呈陽性;菌株RW18不利用檸檬酸鈉、吲哚及苯丙氨酸脫氨酶，試驗不變色，且不能使明膠發(fā)生液化，但能使淀粉水解、過氧化氫酶產氣、硝酸鹽還原，二乙酰（V-P）及硫化氫試驗呈陽性。

2.2? PCR產物電泳及其產物回收

對各菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌體進行收集，并提取總DNA，將各菌株基因組DNA稀釋到20 ng/μL，并以此為模板進行PCR擴增，其擴增產物電泳見圖1。各菌株DNA PCR擴增條帶明亮，無雜帶，片段長度約為1 500 bp，與16S rDNA序列分析方法片段大小一致。將各菌株DNA PCR擴增產物進行回收，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，回收產物無雜帶，明亮。

2.3? DNA PCR擴增產物的轉化及質粒提取

將菌株DNA的PCR擴增回收產物進行陽性克隆，在每個菌株的藍白斑平板上隨機挑取5個白色菌落進行液體培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進行PCR擴增，檢測是否成功克隆轉化子。各菌株轉化子菌落電泳見圖2。由圖2可知，各菌株轉化子均擴增得到約1 500 bp的條帶，均為陽性克隆。對陽性克隆進行重組質粒DNA提取，以重組質粒DNA為模板進行PCR擴增，其電泳見圖2。由圖2可知，在約1 500 bp處擴增出特異性明亮條帶，初步說明各菌株的16S rDNA序列已成功插入pMD18載體上。

2.4? 菌株序列分析

將各菌株的重組質粒DNA送交上海生物工程公司進行測序，測序結果表明，菌株LC15的目的基因長度為1 441 bp，菌株LC20的目的基因長度為1 429 bp，菌株RW18為1 430 bp。3菌株的目的基因長度接近16S rDNA基因片段的長度，符合試驗目的。采用BLAST程序對3菌株的16S rDNA序列與GanBank中已登錄細菌的16S rDNA序列進行同源性比較，結果發(fā)現(xiàn)，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列于多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過99.00%，其中菌株LC15、LC20分別與Klebsiella pneumoniae strain 26（HQ259959）、Klebsiella variicola strain7（HQ259961）的同源性高達99.51%和99.93%;菌株RW18與勒克氏菌屬中Leclercia adecarboxylata（HQ242722）的核苷酸序列同源性為99.79%。菌株LC15與LC20的相似性達到99.37%。

依據(jù)上述比對結果及各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步歸屬為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細菌;將菌株RW18歸屬為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）。菌株LC15、LC20與RW18的16S rDNA序列同源性系統(tǒng)進化樹見圖3。

3? 討論

促生菌接種于農牧作物具有重要作用，例如韓文星[3]、葉喜文等[4，5]、Hariprased等[6]及朱培淼等[7]以溶磷菌為主的PGPR促生菌接種到各試驗材料后的結果表明，作物鮮重、干重、株高、根長、葉綠素含量、穗長、有效分蘗數(shù)以及吸收磷量和根際土壤有效磷含量均較對照或單施N、P、K有不同程度的增加;沈德龍等[8]從水稻中分離的成團腸桿菌YA19可分泌4種生長激素，其中的分裂素包括玉米素核苷、二氫玉米素核苷及異戊烯腺嘌呤;由芽孢桿菌組成的復合解磷菌劑廣泛用于水稻、豌豆等多種農作物及牧草上，對發(fā)揮解磷功能和提高農牧作物產量具有很好的效果[9];王煒等[10]研究復合菌肥對油菜生長的影響結果表明，其鮮重、葉綠素a及葉綠素b均隨復合菌肥用量的增加而升高;牛廷香等[11]將溶磷菌嫁接到柑桔幼苗后，對改善植株磷素營養(yǎng)和促進苗木生長均有明顯作用。此外，胡曉峰等[12]分離到的一株溶磷細菌，對辣椒疫霉、大麗輪枝菌、煙草疫霉煙草變種和立枯絲核菌有拮抗作用。因此，鑒定本研究中的3株優(yōu)良菌株意義重大，為后期研究3株菌株對農牧作物的相關作用奠定基礎。

隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，人類對微觀世界的認識也在不斷深入。特別是現(xiàn)代分子生物學的迅速發(fā)展，使得細菌的分類與鑒定更為科學。目前，對細菌的鑒定方法較多，如16S rDNA序列分析、PCR技術、質粒圖譜分析法、化學分類鑒定法及核酸雜交技術等。本研究采用16S rDNA序列分析法對3株溶磷菌進行了初步鑒定，并初步確定了菌株LC15與LC20為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細菌，菌株RW18為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）細菌，由于未對這3株菌的微觀形態(tài)和革蘭氏染色等進行觀察，所用鑒定方法單一，未鑒定到種。

參考文獻：

[1] 中國科學院微生物研究所.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].第九版.北京：科學出版社，1994.

[2] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

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[4] 葉喜文，焦? 峰，吳金花，等.PGPR促生菌肥在水稻上應用效果研究[J].黑龍江八一農墾大學學報，2005，17（1）：9-11.

[5] 張? 堃，張德罡，姚? 拓，等.PGPR菌肥制作及其對高寒牧區(qū)3種禾本科牧草苗期株高的影響[J].草原與草坪，2006（3）：49-52.

[6] HARIPRASED P，NIRANJANA S R. Isolation and characterization of phosphate solubilizing rhisobacteria to improve plant health of tomato[J].Plant Soil，2009，316：13-24.

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[10] 王? 煒，咸拴獅.復合菌肥對鋅污染土壤中油菜生長的影響[J].山西農業(yè)科學，2008，36（1）：73-75.

[11] 牛廷香，鄧? 烈，易時來，等.溶磷菌對柑桔嫁接苗磷素營養(yǎng)及生長發(fā)育的影響[J].中國南方果樹.2011，40（3）：11-14.

[12] 胡曉峰，郭晉云，張? 楠.一株溶磷抑病細菌的篩選及其溶磷特性[J].中國農業(yè)科學，2010，43（11）：2253-2260.

收稿日期：2020-04-10

基金項目：國家自然科學基金項目（30960265）;貴州省農業(yè)攻關項目[黔科合NY（2009）3067]

作者簡介：李顯剛（1983-），男，貴州遵義人，畜牧師，碩士，主要從事草原監(jiān)測監(jiān)管及草地微生物資源與生態(tài)研究方面的工作，（電話）13595404735

（電子信箱）578912809@qq.com;通信作者，姚? 拓（1968-），男，甘肅靖遠人，教授，博士，主要從事草業(yè)科學（草地微生物和草地保護）

教學及研究工作，（電話）15002623079。