復合纖維素酶菌劑降解禽畜糞便動力學過程研究

成福 王萬能

摘要：在自然堆肥過程中，禽畜糞便熟化是一個溫度不斷變化的過程，當堆肥溫度低于或高于微生物菌群的最適溫度時，微生物產(chǎn)酶效率低下甚至不產(chǎn)酶，導致禽畜糞便堆肥過程中纖維素的降解效率較低，費時較長。研究開發(fā)了一種復合菌劑，發(fā)酵菌劑按體積比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌的培養(yǎng)液共30L，混合成復合菌劑，并將其應用于堆肥降解禽畜糞便纖維素。復合菌劑中各菌種的最適產(chǎn)酶溫度與堆肥發(fā)酵不同階段溫度相對應，可以在堆肥過程中不同發(fā)酵溫度階段都能持續(xù)產(chǎn)酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解。添加菌劑后可提前提高禽畜糞便發(fā)酵堆肥纖維素酶活性的水平及其峰值，縮短堆肥發(fā)酵時間，對堆肥的適應性及腐熟效果好。

關鍵詞：禽畜糞便;堆肥;復合菌劑;纖維素酶

中圖分類號：S-3文獻標識碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815004

收稿日期：2020-07-03

基金項目：蘇北科技發(fā)展計劃—科技富民強縣項目（項目編號：BN2015010）

作者簡介：成福（1999-），男，碩士在讀。研究方向：微生物與生化藥學;通訊作者王萬能（1971-），男，博士，教授。研究方向：生物代謝調(diào)控。

由于集約化禽畜生產(chǎn)迅速發(fā)展，禽畜糞便的產(chǎn)生量急劇增加，對環(huán)境造成了嚴重威脅[1]。2001年，全國禽畜糞便年排放量已高達18.84億t，并且還在持續(xù)增加，是工業(yè)廢棄物年排放量的約3.4倍。畜禽糞便中含有大量的有機物，其中纖維素含量較多[2]。禽畜糞便的隨意排放會污染土壤、地下水以及對植物生長產(chǎn)生影響，甚至引起植物死亡[3]。目前，纖維素的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法耗能高，化學法在濃酸濃堿處理后，帶來新的環(huán)境問題。而生物法利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶進行降解，具有反應條件溫和，高效無化學污染的特性[4]，適合禽畜糞便的處理。目前，市場上已有的多種商業(yè)纖維素酶，大部分都是由木霉屬和曲霉屬菌株生產(chǎn)得到的[5]。自然堆肥禽畜糞便的熟化速度慢，并且不易起溫，達不到我國堆肥無害化處理標準，添加商業(yè)纖維素酶的又使得成本較高，不利于大規(guī)模處理。若能在堆肥過程中利用纖維素降解菌降解纖維素，不但可以促進堆肥的熟化進程，而且能提高堆肥的質(zhì)量。但是在自然堆肥過程中，禽畜糞便熟化過程是一個溫度不斷變化的過程，當堆肥溫度低于或高于微生物菌群的最適溫度時，微生物產(chǎn)酶效率低下甚至不產(chǎn)酶，導致禽畜糞便堆肥過程中纖維素的降解效率較低、費時較長。如，北方地區(qū)冬季溫度偏低，很多微生物的活動受到抑制，不能充分發(fā)揮作用。篩選低溫產(chǎn)纖維素酶菌可以在低溫條件下高效反應提高纖維素的降解率[6]。所以需要尋找具有特殊活性的產(chǎn)酶菌株，耐低溫、高溫纖維素酶等。利用各菌種的協(xié)同作用來高效快速地降解纖維素，選取一些功能菌株進行組合獲得混合菌種的復合菌劑，提高禽畜糞便中纖維素的轉(zhuǎn)化效率[7]。

因此，針對現(xiàn)有技術不足，研究開發(fā)了一種復合菌劑，由最適低溫產(chǎn)酶菌、最適常溫產(chǎn)酶菌、最適高溫產(chǎn)酶菌組成，使得菌劑各菌種的最適產(chǎn)酶溫度與堆肥發(fā)酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協(xié)同生長，形成較為穩(wěn)定的產(chǎn)纖維素酶環(huán)境，在堆肥過程不同發(fā)酵溫度階段都能持續(xù)產(chǎn)酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解，為高效降解禽畜糞便中的纖維素，提高其使用和轉(zhuǎn)化效率有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

養(yǎng)殖場禽畜糞便，其有機質(zhì)含量79%，碳氮比（C/N）16，含水量65%，pH值7.21;稻殼粉。

菌種：里氏木霉（Trichoderma reesei），購自北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司;假單胞菌（Pseudomonadaceae）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10441;近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 1257;枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subspecies）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10832;煙曲霉（Aspergillus funigatus）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 2434;嗜熱液化芽胞桿菌（Bacillus thermoliquefaciens）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 20647。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH 7.4～7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar Medium）：馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH自然。

氫氧化鈉：成都市科隆化學品有限公司;酒石酸鉀鈉：成都市科隆化學品有限公司;苯酚：成都市科隆化學品有限公司;亞硫酸鈉：成都市科隆化學品有限公司;重鉻酸鉀：成都市科隆化學品有限公司。

1.2儀器與設備

生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;ZHWY-2102c恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司;高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司;pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司;紫外分光光度計：上海儀電儀器分析有限公司;自動壓力蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1復合菌劑制備

復合菌劑細菌菌種由最適低溫產(chǎn)酶菌、最適常溫產(chǎn)酶菌、最適高溫產(chǎn)酶菌組成。最適低溫產(chǎn)酶菌為假單孢菌，最適常溫產(chǎn)酶菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種，最適高溫產(chǎn)酶菌為嗜熱液化芽孢桿菌。復合菌劑真菌菌種由最適低溫產(chǎn)酶菌、最適常溫產(chǎn)酶菌、最適高溫產(chǎn)酶菌組成，其中，最適低溫產(chǎn)酶菌為里氏木霉，最適常溫產(chǎn)酶菌為近平滑假絲酵母菌，最適高溫產(chǎn)酶菌為煙曲霉。取里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌，其中，假單孢菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、嗜熱液化芽孢桿菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)60～72h，至活菌數(shù)均達到108個·mL-1，培養(yǎng)溫度為28℃;里氏木霉、近平滑假絲酵母菌、煙曲霉分別在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)96h，至有效活菌數(shù)均達到104CFU·g-1左右，培養(yǎng)溫度為26℃。按體積比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取調(diào)節(jié)好濃度的里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌的培養(yǎng)液，共計30L，混合成復合菌劑，備用。

1.3.2堆肥發(fā)酵

取養(yǎng)殖場禽畜糞便600kg，測定其有機質(zhì)含量為79%，碳氮比（C/N）為16，含水量為65%，pH值為7.21。將禽畜糞便用30kg稻殼粉調(diào)節(jié)禽畜糞便水分含量至50%～55%，堆在2m×1m×0.5m的發(fā)酵箱體中。取復合菌劑添加進發(fā)酵箱體禽畜糞便中，攪拌均勻，并覆蓋薄膜保溫。堆肥過程中，采用乙醇溫度計測定堆溫，記錄堆肥溫度變化。對照組取相同重量的禽畜糞便并經(jīng)同樣處理后堆在2m×1m×0.5m的發(fā)酵箱體中。對照組按體積比1∶1取近平滑假絲酵母菌和枯草芽孢桿菌枯草亞種培養(yǎng)液，共計30L，添加進發(fā)酵箱體中，攪拌均勻，并覆蓋薄膜保溫。

1.3.3堆肥中有機質(zhì)含量及碳氮比（C/N）檢測

堆肥過程中，每天取樣檢測分析堆肥物質(zhì)變化情況，樣品為多點混合樣。采用K2Cr2O7容量法測定各混合樣的有機質(zhì)含量[8]。采用國家農(nóng)業(yè)標準NY525-2011測定各混合樣中C/N含量[9]，并采用3.5-二硝基水楊酸顯色法測定各混合樣中纖維素酶活性[10]。

2結果與分析

2.1堆肥過程中溫度變化

堆肥溫度是從表觀上判定堆肥腐熟程度的重要指標，溫度通過影響微生物活性和有機物降解速率控制發(fā)酵進程。加入菌劑處理之后，試驗組在堆肥過程中逐漸產(chǎn)生有腐熟的氣味，到13d堆肥質(zhì)地變疏松，堆肥由黑色變?yōu)楹诤稚?，表明此時熟化完成。而對照組在堆肥發(fā)酵過程中腐熟氣味的產(chǎn)生稍晚于試驗組，而且到第18天時堆肥質(zhì)地才變疏松，堆肥由黑色變?yōu)楹诤稚瓿墒旎瘯r間較試驗組晚。在整個堆肥過程中，試驗組同對照組一樣，堆肥溫度隨時間的變化呈先上升后下降的變化曲線。菌劑中各菌種的最適產(chǎn)酶溫度與堆肥發(fā)酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協(xié)同生長，形成較為穩(wěn)定的產(chǎn)纖維素酶環(huán)境，在堆肥過程不同發(fā)酵溫度階段都能持續(xù)產(chǎn)酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解。試驗組在堆肥發(fā)酵3d后，達到最高溫度63℃，維持3d后，溫度逐漸下降，如圖1。對照組在6d達到最高溫度56℃，較試驗組堆肥3d就達到最高溫度63℃還是有不少的差距，充分表明復合菌劑的作用加快了反應的進程。試驗組與對照組相比，試驗組堆肥升溫早、升溫快，堆肥中加入復合微生物菌劑可提高溫度峰值，且高溫持續(xù)時間較長，腐熟效果更好，試驗組堆肥降解速率加快，纖維素降解效率提高，加快了堆肥發(fā)酵速度，縮短了堆肥發(fā)酵時間。

2.2堆肥纖維素酶活性變化

酶活性直接影響堆肥的腐熟進程和發(fā)酵的強度，畜禽糞便中含有大量難以降解的纖維素，通過對堆肥中纖維素酶活性的測定，可以了解堆肥中纖維素降解的情況。試驗加入復合菌劑進行堆肥后，記錄第1天初始溫度。堆肥前期，堆肥溫度隨時間的變化而不斷升高至最高溫度63℃，堆肥中的纖維素酶活性隨之升高，至發(fā)酵結束，纖維素酶活性保持在1.3～1.6U·g-1較高水平。至高溫63℃之后，直至熟化完成堆肥中的纖維素酶下降趨勢小，最后維持在1.2U·g-1的水平。而對照組堆肥中的纖維素酶活性在6d后才達到最高1.2U·g-1，表明加入復合菌劑后，可以提高纖維素酶的活力，加快反應的進行。由于試驗組提前提高禽畜糞便發(fā)酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，禽畜糞便發(fā)酵堆肥中纖維素酶活性峰值比傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑堆肥方法提前5d，且纖維素酶活性一直維持在較高水平，表明復合菌劑中各菌種積極發(fā)揮作用，協(xié)同提高纖維素的降解效率，纖維素酶活力隨時間的變化曲線如圖2。

2.3堆肥有機質(zhì)含量及C/N變化

堆肥發(fā)酵進行熟化，取樣測定發(fā)現(xiàn)試驗組堆肥在15d后有機質(zhì)含量為386.3g·kg-1，堆肥熟化完畢后有機質(zhì)含量降至61%。對照組堆肥在15d有機質(zhì)含量為436.8g·kg-1，堆肥熟化完畢后有機質(zhì)含量降至67%。由堆肥中有機質(zhì)的變化量可知，試驗組與對照組相比，試驗組對禽畜糞便中有機質(zhì)的降解效果更好，實驗組的有機質(zhì)含量下降幅度較對照組更大，表明該復合菌劑可有效促進禽畜糞便中有機質(zhì)的降解。C/N也是評價禽畜糞便發(fā)酵熟化度的常用方法之一，試驗組堆肥C/N值熟化完畢后，測定C/N結果顯示為12.6，對照組堆肥熟化完畢后C/N為14.8，表明該復合菌劑可加快堆肥熟化的進程，提高禽畜糞便熟化度。

3結論

由于本試驗復合菌劑中的最適高、常、低溫產(chǎn)酶菌具有協(xié)同關系，組成的最適產(chǎn)酶溫度與堆肥發(fā)酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協(xié)同生長，堆肥發(fā)酵過程中，各溫度階段都有最適的產(chǎn)纖維素微生物菌種大量繁殖，持續(xù)產(chǎn)生纖維素酶，使復合菌劑在不同發(fā)酵溫度階段都能持續(xù)產(chǎn)酶，形成穩(wěn)定的產(chǎn)纖維素酶微環(huán)境，酶活力較為穩(wěn)定，可有效促進堆肥過程中纖維素的降解，可加快堆肥熟化的進程，提高禽畜糞便熟化度，而且對堆肥的適應性及腐熟效果都要強于傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑堆肥。采用復合菌劑處理禽畜糞便，與傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑堆肥相比，該復合菌劑可以提前提高禽畜糞便發(fā)酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，比傳統(tǒng)發(fā)酵菌劑堆肥提前2～3d出現(xiàn)，且纖維素酶活性一直持續(xù)在較高水平，利于降解禽畜糞便中的纖維素，有助于推進農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用，在開辟新的環(huán)境治理和能源開發(fā)思路具有重要的理論和實踐意義，特別是對環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展將會起到?jīng)Q定性的作用。

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（責任編輯周康）