參附注射液調(diào)控大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的表達(dá)機(jī)制

蘇天生　羅繼紅　盧靜　陳志斌 王志民　廖云海　林磊

【摘要】 目的：研究參附注射液對大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的調(diào)控機(jī)制。方法：將60只健康SD大鼠隨機(jī)分為三組，每組20只。模型組和參附注射液組行結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）術(shù)建立心肌梗死模型，假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈不做結(jié)扎。模型組和假手術(shù)組予以0.9%氯化鈉注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，參附注射液組予以參附注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，連續(xù)給藥12周。比較三組大鼠心肌質(zhì)量指數(shù)。采用Realtime RT-PCR方法檢測大鼠心肌microRNA-135a的表達(dá)。結(jié)果：參附注射液組和模型組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)及左心室重量指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，且模型組高于參附注射液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌microRNA-135a表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達(dá)量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：microRNA-135a在心肌梗死中可能發(fā)揮重要作用，參附注射液可能通過抑制microRNA-135a的上調(diào)，抑制心肌梗死大鼠心室重構(gòu)，從而改善大鼠心功能。

【關(guān)鍵詞】 參附注射液 心肌梗死 microRNA-135a

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.16.001 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）16-000-03

Mechanism of Shenfu Injection Regulating the Expression of MicroRNA-135a in Rat Model of Myocardial Infarction/SU Tiansheng， LUO Jihong， LU Jing， CHEN Zhibin， WANG Zhimin， LIAO Yunhai， LIN Lei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（16）： -3

[Abstract] Objective： To explore the regulation mechanism of Shenfu Injection on microRNA-135a in rat model of myocardial infarction. Method： A total of 60 healthy SD rats were randomly divided into three groups， with 20 rats in each group. The left anterior descending coronary artery （LAD） was ligated in model group and Shenfu Injection group to establish myocardial infarction model， while the coronary artery in sham operation group was not ligated. Model group and sham operation group were given 0.9% Sodium Chloride Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection， and Shenfu Injection group was given Shenfu Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection for 12 weeks. The myocardial mass index of the three groups was compared. The expression of microRNA-135a in rat myocardial was detected by Realtime RT-PCR. Result： The whole-heart mass index and left ventricular mass index of rats in Shenfu Injection group and model group were significantly higher than those in sham operation group， and the model group was significantly higher than that in Shenfu Injection group， the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with sham operation group， the expression level of microRNA-135a was up-regulated in the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， the expression level of microRNA-135a in rat myocardial was down-regulated in Shenfu Injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： MicroRNA-135a may play an important role in myocardial infarction. Shenfu Injection may improve the cardiac function of rats by inhibiting the up regulation of microRNA-135a and inhibiting the ventricular remodeling of rats with myocardial infarction.

[Key words] Shenfu Injection Myocardial infarction MicroRNA-135a

First-authors address： The Second Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China

急性心肌梗死（AMI）是指由于冠狀動(dòng)脈急性狹窄或閉塞，供血持續(xù)減少或終止，所產(chǎn)生的心肌嚴(yán)重缺血壞死。其主要病理生理機(jī)制是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，由于某些機(jī)械原因（如高血壓或冠狀動(dòng)脈痙攣等）誘發(fā)了易損斑塊的破裂和血栓形成，產(chǎn)生了急性冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄或完全閉塞的結(jié)果。急性心肌梗死在中老年多發(fā)，起病急，發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率高，預(yù)后差。急性心肌梗死發(fā)展為缺血性心肌病、心衰的核心病理生理機(jī)制是心室重構(gòu)，梗死心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致左心室大小、組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1]。阻止或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)是延緩心力衰竭發(fā)生的重要手段。參附注射液有保護(hù)心肌、抗休克、改善心功能和微循環(huán)等作用，在缺血性心臟病中應(yīng)用廣泛，但其對心肌microRNA-135a影響如何，還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）建立急性心肌梗死模型，研究參附注射液對心肌microRNA-135a的表達(dá)機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 儀器 電子天平、顯色劑（Thermo）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）、PCR儀（ABI）、PCR管（Axygen）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國BIORAD公司）

1.1.2 試劑與藥物 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）、miRNA qPCR Detection Kit（TIANGEN）、microRNA-135a引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）、75%乙醇、三氯甲烷、10%水合氯醛、參附注射液（SF，規(guī)格：10 ml/支，四川雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：Z51020664，每毫升參附注射液含人參皂苷0.5 mg，烏頭堿0.1 mg）。

1.1.3 動(dòng)物 清潔級SD大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量220～

290 g，8～12周齡，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號：（閩檢證字）第2013A001號]。隨機(jī)分為三組：模型組（20只）、參附注射液組（20只）、假手術(shù)組（20只）。

1.2 方法

1.2.1 造模 建立大鼠急性心梗模型。通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造模。通過胸腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后仰臥位固定，消毒鋪巾，胸骨左緣3、4肋間開胸，充分暴露心臟和冠狀動(dòng)脈，將冠狀動(dòng)脈左前降支分離，模型組和參附注射液組以4號絲線在冠狀動(dòng)脈左前降支近端約2 mm處結(jié)扎，然后縫合關(guān)胸，假手術(shù)組只開胸分離冠脈左前降支，但不予結(jié)扎。造模成功后每只大鼠予以腹腔注射5 000 U青霉素以防感染，1次/d。

1.2.2 給藥 造模成功7 d后，模型組和假手術(shù)組：腹腔注射0.9%氯化鈉注射液6.0 ml/（kg·d）。參附注射液組：腹腔注射參附注射液6.0 ml/（kg·d），連續(xù)給藥12周。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 大鼠心肌質(zhì)量指數(shù)測定 連續(xù)給藥12周后，處死大鼠取出心臟標(biāo)本，PSB清洗，濾紙吸干，然后用電子天平稱全心質(zhì)量和左心室質(zhì)量。全心質(zhì)量指數(shù)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量，左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。通過心肌質(zhì)量指數(shù)測定可以間接評估心室重構(gòu)嚴(yán)重程度。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織microRNA-135a的表達(dá)水平 采用Realtime RT-PCR法分析，首先提取心肌組織RNA，取適量心肌組織在液氮中研磨，加三氯甲烷震蕩，然后用離心機(jī)12 000 r/min離心10 min后棄上清液，以75%乙醇洗滌RNA，再以12 000 r/min

離心10 min后棄上清液加適量DEPC水溶解RNA。RNA溶液稀釋后行濃度測定，用紫外分光光度計(jì)測定RNA樣品在260 nm和280 nm處的OD值，通過OD260/OD280比值鑒定RNA的質(zhì)量和純度，選擇比值在1.8～2.0的樣品，計(jì)算其濃度。通過頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的microRNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法定量，分析各樣本的microRNA-135a濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)及全心質(zhì)量指數(shù)比較

參附注射液組和模型組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)及左心室重量指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，且模型組高于參附注射液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.2 三組大鼠心肌microRNA-135a的表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌microRNA-135a表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達(dá)量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

3 討論

急性心肌梗死在臨床上可通過癥狀體征、心電圖、心肌酶譜和肌鈣蛋白來診斷。因該病起病急，發(fā)病兇險(xiǎn)，預(yù)后較差，故近年來對急性心梗預(yù)防越來越重視，用于診斷該病的檢測指標(biāo)的研究也日新月異，其中microRNAs與心肌梗死診斷的相關(guān)性研究較為熱門[1-2]。microRNAs是一種非編碼的小RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程中起重要作用。研究表明，microRNAs在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等心血管疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-8]，但microRNAs在急性心肌梗死的作用通過調(diào)控哪些靶基因表達(dá)及其跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)仍未完全明確。有研究表明，microRNA-135a與心臟病關(guān)系密切，microRNA-135a參與大鼠心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控，通過介導(dǎo)各種靶基因調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡通路，影響細(xì)胞存活與死亡[9]。

急性心肌梗死屬于中醫(yī)學(xué)“真心痛”范疇，真心痛是胸痹進(jìn)一步發(fā)展的嚴(yán)重病證，其特點(diǎn)為劇烈而持久的胸骨后疼痛，伴心悸、水腫、肢冷、喘促、汗出、面色蒼白等癥狀，甚至危及生命?！鹅`樞·厥論》謂：“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死?！?，其病因病機(jī)與年老體衰、陽氣不足、七情內(nèi)傷、氣滯血瘀、痰濁化生、寒邪侵襲、血脈凝滯等因素有關(guān)。本虛是發(fā)病基礎(chǔ)。若心氣不足，運(yùn)血無力，心脈瘀阻，心血虧虛，氣血運(yùn)行不利，可見胸痛、心動(dòng)悸，脈結(jié)代（心肌梗死、心律失常），或亡陽厥脫（心源性休克）。本病病位在心，其本在腎。故治療上可予以溫腎回陽救逆、益氣固脫。本研究使用的參附注射液是據(jù)明代薛己著作《正體類要》中的參附湯制成的中藥靜脈注射劑，由人參、附子兩味中藥的提取物混合而成，有回陽救逆益氣固脫的功效。

參附注射液對循環(huán)系統(tǒng)有顯著的作用，有較好的升壓、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、防治全身多器官缺血再灌注損傷的作用。目前參附注射液已廣泛應(yīng)用于臨床急危重癥搶救，其對心肺復(fù)蘇后多器官的保護(hù)作用越來越受到重視。有研究表明，參附注射液可減輕心肺復(fù)蘇后大鼠心肌損傷和大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，并具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能的作用[10]。參附注射液可改善急性心肌梗死后缺血再灌注患者心臟功能，并能提高患者的后期康復(fù)率和生活質(zhì)量[11-12]。胡丹丹等[13]通過參附注射液對膿毒癥大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)影響的研究，表明參附注射液可有效保護(hù)大鼠損傷再灌注心肌損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善膿毒癥實(shí)驗(yàn)大鼠心臟功能，故參附注射液保護(hù)急性心肌梗死患者心功能，可能與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，而且有可能通過減少microRNA-135a表達(dá)進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。然而參附注射液在對心肌microRNA的調(diào)控方面尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達(dá)量較模型組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。參附注射液組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)及左心室重量指數(shù)均明顯較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。故microRNA-135a在心肌梗死中可能發(fā)揮重要作用，參附注射液可能通過抑制microRNA-135a的上調(diào)，抑制心肌梗死大鼠心室重構(gòu)，從而改善大鼠心功能。

綜上所述，參附注射液抑制microRNA-135a的表達(dá)水平是其治療急性心肌梗死重要分子機(jī)制之一。由于心肌梗死心室重構(gòu)與多種microRNAs有關(guān)，本研究該不夠深入，參附注射液是否還通過其他microRNAs調(diào)控心肌梗死心室重構(gòu)，還有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2020-02-13） （本文編輯：桑茹南）