苗藥貴州蜘蛛抱蛋鎮(zhèn)咳抗炎作用的有效部位篩選*

高永躍，屈相玲，王 璞

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003)

貴州蜘蛛抱蛋隸屬于百合科蜘蛛抱蛋屬植物的全草，為《貴州中草藥資源》收載品種，在貴州苗族習(xí)慣性用藥中主要用于肺虛咳嗽，咯血，急慢性支氣管炎，肺炎恢復(fù)期，慢性咽炎，月經(jīng)不調(diào)，骨折[1]。為更好的研究貴州蜘蛛抱蛋的作用機(jī)制，為貴州蜘蛛抱蛋深層次的開(kāi)發(fā)利用和創(chuàng)制新藥打下基礎(chǔ)，本文對(duì)貴州蜘蛛抱蛋鎮(zhèn)咳、抗炎有效部位進(jìn)行篩選研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

貴州蜘蛛抱蛋經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授準(zhǔn)確鑒定為百合科蜘蛛抱蛋屬植物貴州蜘蛛抱蛋Aspidistraguizhouensis的干燥根狀莖及地上部分。貴州蜘蛛抱蛋10 kg，采用95%的乙醇分別回流提取4 h，3 h，3 h，回收乙醇，濃縮，再用乙酸乙酯和石油醚分別萃取，獲得乙酸乙酯提取部位365.15 g，石油醚提取部位43.32 g，水層提取部位163.52 g。依據(jù)貴州蜘蛛抱蛋在民間成人使用的平均使用量20 g/日，配制相當(dāng)于成人劑量的20倍、10倍、5倍的高、中、低劑量組。

1.2 對(duì)照藥物

巖果止咳液(貴州光正制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20013188，產(chǎn)品批號(hào)：HAF0416)，成人劑量：一次20 mL，一日3次，即相當(dāng)于1 mL/kg。小鼠實(shí)驗(yàn)用量為10 mL/kg，相當(dāng)于成人劑量的10倍。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配置成1.55%，給藥劑量20 mL/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.3.1 試劑

25%氨水，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180412；99%硫酸，成都市科龍化工試驗(yàn)場(chǎng)，批號(hào)：20120704；無(wú)水亞硫酸鈉，重慶吉元化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170326；二甲苯，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120122；氯化鈉注射液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20180115；角叉萊膠，瑞士Fluka公司進(jìn)口，批號(hào)：CH-9826；伊文思藍(lán)，瑞士Fluka公司進(jìn)口，批號(hào)：CH-9826；冰醋酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141015。

1.3.2 儀器

電子天平，上海菁海儀器有限公司；超聲霧化器，浙江瑞騰醫(yī)療器械有限公司；L600臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠(20±2)g，雌雄各半(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO：00200406，許可證號(hào)：SCXK-(黔)2012-001)。飼料：全價(jià)顆粒飼料(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.5 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地

貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度20 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。溫濕度適宜，環(huán)境衛(wèi)生，通風(fēng)條件良好。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)處理以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，比較各組間及對(duì)照組是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位的鎮(zhèn)咳作用研究[2-3]

取昆明小鼠154只(20±2)g，分別稱重，雌雄各半，隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組(乙酸乙酯高、中、低劑量組，石油醚高、中、低劑量組及水提取部位高、中、低劑量組)，對(duì)照組，正常組，每組分配昆明小鼠14只，共計(jì)分為11組。給予每組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，即0.1 mL/10g，每日1次，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后1 h即將每只小鼠放入倒置的500 mL容量的燒杯中，將一定量25%的氨水用超聲噴霧器噴入燒杯內(nèi)，觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期“s”、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，結(jié)果顯示：貴州蜘蛛抱蛋的乙酸乙酯提取部位鎮(zhèn)咳作用顯著(p<0.01)，優(yōu)于對(duì)照組(p<0.001)。詳見(jiàn)表1。

表1 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)氨水引咳小鼠止咳作用(x±s，N=12)Tab. 1 Antitussive effect of different extractive parts of Aspidistra guizhouensis on ammonium water induced cough in mice(x±s，N=12)

3.2 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)小鼠二氧化硫引咳的鎮(zhèn)咳作用

取昆明小鼠154只(20±2)g，分別稱重，雌雄各半，隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組(乙酸乙酯高、中、低劑量組，石油醚高、中、低劑量組及水提取部位高、中、低劑量組)，對(duì)照組，正常組，每組分配昆明小鼠14只，共計(jì)分為11組。給予每組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，即0.1 mL/10g，每日1次，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后1 h即將每只小鼠放入倒置的500 mL容量的燒杯中，將0.5 g無(wú)水硫酸鈉加入盛有5 mL 50%硫酸的蒸發(fā)皿中，隨即將蒸發(fā)皿的入燒杯內(nèi)，觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期“s”、2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，結(jié)果顯示：貴州蜘蛛抱蛋的高劑量及中等劑量乙酸乙酯提取部位及高劑量石油醚提取部位有鎮(zhèn)咳作用(p<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)SO2引咳小鼠止咳作用(x±s，N=12)Tab.2 Antitussive effect of different extractive parts of Aspidistra guizhouensis on SO2 induced cough in mice(x±s，N=12)

3.3 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位抗炎作用研究[4-5]

取昆明小鼠154只(20±2)g，分別稱重，雌雄各半，隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組(乙酸乙酯高、中、低劑量組，石油醚高、中、低劑量組及水提取部位高、中、低劑量組)，對(duì)照組，正常組，每組分配昆明小鼠14只，共計(jì)分為11組。給予每組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，即0.1 mL/10g，每日1次，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后1 h分別在每只小鼠右耳正反面涂上二甲苯，用量為0.03 mL/只，左耳作為對(duì)照，15 min后脫頸法處死小鼠，沿耳廓剪下小鼠雙耳，用打孔器分別在雙耳適宜部位取直徑為8 mm的耳片，逐一進(jìn)行稱重(mg)，腫脹度為右耳片重量減去左耳片重量之差，求每一組的腫脹度抑制率(%)，腫脹度抑制率(%)=(正常組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/正常組平均腫脹度×100%。結(jié)果，貴州蜘蛛抱蛋不同濃度的乙酸乙酯提取部位、石油醚提取部位及水層提取部位均有較明顯的抗炎作用(P<0.01)，且不同提取部位對(duì)腫脹度的抑制率均大于30%，表明貴州蜘蛛抱蛋不同提取物對(duì)二甲苯所致的急性炎癥模型均有抑制作用。詳見(jiàn)表3。

表3 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)二甲苯致小鼠急性炎癥耳腫脹的抑制作用(x±s，N=12)Tab.3 Inhibiting effect of different extractive parts of Aspidistra guizhouensis on xylene induced acute inflammatory ear swelling in mice(x±s，N=12)

3.4 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

取昆明小鼠154只(20±2)g，分別稱重，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(乙酸乙酯高、中、低劑量組，石油醚高、中、低劑量組及水提取部位高、中、低劑量組)，對(duì)照組，正常組，每組分配昆明小鼠14只，共計(jì)分為11組。給予每組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，即0.1 mL/10g，每日1次，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后1 h，按給藥劑量0.2 mL/10g分別向小鼠尾部注射0.5%的伊文思藍(lán)生理鹽水溶液，隨之給每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL，半小時(shí)后再給每只小鼠腹腔注射生理鹽水5 mL脫頸法處死小鼠，打開(kāi)腹腔，吸取腹腔液3～5 mL注入試管內(nèi)，用生理鹽水分別加到6 mL，置入L600臺(tái)式低速離心機(jī)，離心速度1000 rpm，離心5 min后取上清液加入比色杯內(nèi)，用721分光光度計(jì)測(cè)590 nm處的吸光度(OD值)。結(jié)果，貴州蜘蛛抱蛋中等劑量乙酸乙酯部位抗炎作用顯著(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性作用(x±s，N=12)Tab.4 Effect of different extractive parts of Aspidistra guizhouensis on peritoneal capillary permeability of mice(x±s，N=12)

3.5 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)角叉膠致小鼠亞急性炎癥足跖腫脹的抑制作用

取昆明小鼠154只(20±2)g，分別稱重，雌雄各半，隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組(乙酸乙酯高、中、低劑量組，石油醚高、中、低劑量組及水提取部位高、中、低劑量組)，對(duì)照組，正常組，每組分配昆明小鼠14只，共計(jì)分為11組。給予每組小鼠灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，即0.1 mL/10g，每日1次，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后1 h，以小鼠踝關(guān)節(jié)以上長(zhǎng)毛部位為界限，分別剪取小鼠左右雙足進(jìn)行稱量(g)，以致炎右足減去左足的重量差為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率(%)，腫脹抑制率(%)=(正常組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/正常組平均腫脹度×100%。結(jié)果，貴州蜘蛛抱蛋中等劑量乙酸乙酯組與低劑量乙酸乙酯組、石油醚組以及低劑量水層組對(duì)角叉膠致小鼠亞急性炎癥足跖腫的抑制作用顯著(P<0.01)，且不同提取部位對(duì)腫脹度的抑制率均大于30%。

4 討論

咳嗽為呼吸系統(tǒng)的一種保護(hù)性反射，正常咳嗽有助于呼吸道中異物和黏液的排出，對(duì)呼吸道的通暢與清潔具有作用。但病理性咳嗽能夠使肺內(nèi)壓增高，而支氣管炎、肺結(jié)核等所致的劇烈咳嗽還可導(dǎo)致肺泡壁彈性減弱，長(zhǎng)時(shí)間還會(huì)導(dǎo)致肺泡破裂，形成肺大泡[6]。

表5 貴州蜘蛛抱蛋不同提取部位對(duì)角叉膠致小鼠亞急性炎癥足跖腫脹的抑制作用(x±s，N=12)Tab.5 Inhibiting effect of different extractive parts of Aspidistraguizhouensis on carrageenan induced subacute inflammatory paw swelling in mice(x±s，N=12)

炎癥是指生物組織收到創(chuàng)傷或感染后被病原體感染，由機(jī)體本身的防御造成的一系列基本病理反應(yīng)[6]。早期炎癥以通透性增加、毛細(xì)血管擴(kuò)張及炎癥腫脹為主要特征，并常伴有炎癥腫脹、白細(xì)胞趨化游走等；晚期炎癥則以結(jié)締組織增生、肉芽腫形成為主要特征。一些自身免疫性疾病甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生都與長(zhǎng)期炎癥相關(guān)。因此，咳嗽與炎癥對(duì)人體的危害不容忽視。貴州蜘蛛抱蛋隸屬于百合科蜘蛛抱蛋屬植物的全草，為《貴州中草藥資源》收載品種，在貴州苗族習(xí)慣性用藥中主要用于肺虛咳嗽，咯血，急慢性支氣管炎，肺炎恢復(fù)期，具有慢性咽炎，療效確切，不易復(fù)發(fā)，毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，具有較好的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值[7～9]。本文應(yīng)用氨水、二氧化硫經(jīng)典引咳試劑制作小鼠咳嗽模型，篩選貴州蜘蛛抱蛋有效鎮(zhèn)咳部位；用二甲苯、冰醋酸制作急性炎癥模型及用角叉萊膠致小鼠足跖腫脹制作亞急性炎癥模型，篩選貴州蜘蛛抱蛋有效抗炎部位，結(jié)果顯示，貴州蜘蛛抱蛋乙酸乙酯提取部位的鎮(zhèn)咳及抗炎作用顯著。本試驗(yàn)從科學(xué)角度驗(yàn)證了苗藥貴州蜘蛛抱蛋鎮(zhèn)咳與抗炎作用，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)咳和抗炎的有效成分主要存在于乙酸乙酯提取部位，為貴州蜘蛛抱蛋的臨床應(yīng)用提供了可靠科學(xué)依據(jù)，為苗藥貴州蜘蛛抱蛋的合理開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。