黃芪扶正湯抑制人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的機(jī)制研究*

王亮萍 王鴻程 林 晶 張志明 陳 炯

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院 1 健康管理中心 2 甲狀腺外科 3 風(fēng)濕內(nèi)分泌科，福建省福州市 350000

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，其中分化型甲狀腺癌(DTC)約占所有甲狀腺癌病例的90%[1]。傳統(tǒng)化療藥物對(duì)甲狀腺腫瘤療效普遍不顯著，目前手術(shù)治療仍是甲狀腺腫瘤患者的首選治療方式[2]。中藥，特別是復(fù)方中藥，對(duì)腫瘤的作用是多途徑、多靶點(diǎn)的，對(duì)腫瘤和機(jī)體免疫功能均有影響。Qin JH等[3]指出中醫(yī)藥已廣泛應(yīng)用于亞洲各種疾病的預(yù)防和治療中，其研究也證實(shí)了黃芪扶正湯可以通過(guò)多靶點(diǎn)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并減少順鉑的副作用。黃芪扶正湯作為我國(guó)中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方劑，主要由黃芪、黃精、靈芝、女貞子以及枸杞等組成，這五味復(fù)方中藥均有不同程度提高免疫力、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[4]。但目前，尚未見(jiàn)黃芪扶正湯針對(duì)細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶(CDKs)或Cyclin D、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)通路研究其抗甲狀腺腫瘤機(jī)制的研究，因此，本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)研究法，分析其抗腫瘤的具體機(jī)制，旨在為中醫(yī)黃芪扶正湯的抗腫瘤治療提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1(購(gòu)于上海富衡生物科技有限公司)；胎牛血清(美國(guó)Foundation Medicine公司)；無(wú)血清DMEM、1640培養(yǎng)基、1640完全培養(yǎng)基及DMEM完全培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；無(wú)菌PBS及胰酶(福州生物科技有限公司)；4-甲偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；碘化丙啶(PI)(南京諾唯贊生物科技有限公司)；10mg/ml Rnase A(廈門(mén)安提海拉生物科技有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；引物RB1-QF、RB1-QR、CDK4-QF、CDK4-QR(廈門(mén)安提海拉生物科技有限公司)；RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒、HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR試劑盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)等。

1.2 藥物 黃芪扶正湯(具體組方為：黃芪30g、枸杞15g、靈芝粉15g、黃精15g、女貞子15g)，同一批次統(tǒng)一購(gòu)于本院中藥房。按黃芪扶正湯方的配方稱(chēng)取藥材共90g，加10倍量的水浸泡30min后，武火加熱煮沸，煮沸后改用文火煮沸1h，紗布過(guò)濾，殘?jiān)铀?倍量后重新煎煮一遍，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收溶劑，最后濃縮至60ml，即原生藥濃度為1.5g/ml，放冰箱備用。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱酶標(biāo)儀(HEAL FORCE公司)CO2培養(yǎng)箱離心機(jī)(HEAL FORCE湘儀公司)；高速冷凍離心機(jī)(BBI公司，型號(hào)為HC-3018R)；PCR儀(西安天隆科技公司，型號(hào)為GENESY-96T)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物，型號(hào)為ABI 7300 plus)；微型臺(tái)式真空泵(其林貝爾公司，型號(hào)為GL-802)。

1.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況及半抑制濃度(IC50) 接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，每孔體積100μl。加藥：用培養(yǎng)基配制不同濃度梯度的黃芪扶正湯(20.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.0g/L)，每孔加入100μl。培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)1～2d(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。呈色：培養(yǎng)1～2d后，每孔加MTT溶液(5mg/ml)20μl。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光密度值，記錄結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)來(lái)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況 處理細(xì)胞：以不用藥物濃度對(duì)照組(0g/L)及實(shí)驗(yàn)組(6g/L)(IC50最優(yōu)劑量為6.118g/L，為方便計(jì)算，用6g/L濃度干預(yù))處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h。固定：消化下細(xì)胞，離心，PBS清洗1遍，300μl PBS重懸細(xì)胞，再加入900μl預(yù)冷的無(wú)水乙醇迅速混勻。4℃固定4h或者過(guò)夜，可長(zhǎng)期保存在-20℃。透膜：以300g，5min離心，PBS洗1次。用990μl含0.2% Tritonx-100的PBS重懸細(xì)胞，同時(shí)加入10μl 100mg/ml Rnase A，混勻后置于37℃中30min。染色：以300g，5min離心，PBS洗1次。重懸細(xì)胞，濃度1×106個(gè)/100μl為宜。加入PI，4℃染色30min或室溫10min。上機(jī)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 處理細(xì)胞：黃芪扶正湯以不同濃度(0g/L、6g/L濃度)處理TCP-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h。收集細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，同時(shí)收集培養(yǎng)基和清洗細(xì)胞的PBS中的細(xì)胞。4℃，300g離心5min。染色：PBS清洗1次，4℃，300g離心5min 。100μl染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μl Anexin V-FITC和5μl PI染色液，室溫反應(yīng)10min。上機(jī)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞Rb、CDK4 mRNA的表達(dá)情況 總RNA抽提：按RNA Isolater總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提，將樣本破碎和勻漿：用PBS洗滌一次培養(yǎng)液，每10cm2培養(yǎng)面積的細(xì)胞加入1ml RNA isolater，用移液器將細(xì)胞吹打下來(lái)，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，用移液器反復(fù)吹打直至無(wú)明顯顆粒樣存在，冰上靜置5min后提取RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA：按HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在RNase-free的離心管中配置4 xgDNA wiper Mix 4μl，總RNA 1μg，RNase free ddH2O，共16μl；用移液器輕輕吹打混勻，42℃ 2min。在以上的反應(yīng)液中加入5xHiScript ⅡqRT SuperMixⅡ4μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。qPCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Rb及CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量：按ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在PCR管中配制總體積為20μl的PCR反應(yīng)體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，10μmol/L的上、下游引物、50xROX Reference Dye1，cDNA和ddH2O (反應(yīng)體系中各成分的量可根據(jù)原則自行調(diào)整)。按95℃預(yù)變性30s；40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，95℃反應(yīng)10s，60℃反應(yīng)30s進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以18s RNA為內(nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Rb及CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 黃芪扶正湯對(duì)人TPC-1細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期TPC-1細(xì)胞，經(jīng)對(duì)照組(0g/L)及不同劑量實(shí)驗(yàn)組(0.5、1.0、2.5、5、10g/L)處理后，對(duì)照組的細(xì)胞分裂增殖旺盛，形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)增殖抑制，通過(guò)IC50評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)，最優(yōu)濃度為6.118g/L，為方便計(jì)算，后續(xù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組采用6g/L濃度干預(yù)細(xì)胞(圖1)。

圖1 黃芪扶正湯處理后人TPC-1細(xì)胞的存活率

2.2 黃芪扶正湯對(duì)人TPC-1細(xì)胞周期的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪扶正湯6g/L作用TPC-1細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；S期、G2/M期細(xì)胞比例降低，與對(duì)照組相比，S期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組黃芪扶正湯6g/L處理TPC-1細(xì)胞后可引起細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理人TPC-1細(xì)胞后的周期流式圖

圖3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理人TPC-1細(xì)胞后的周期分布統(tǒng)計(jì)圖

2.3 黃芪扶正湯對(duì)人TPC-1細(xì)胞凋亡的影響 流式凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(6g/L)和對(duì)照組(0g/L)細(xì)胞的凋亡率分別為22.55%、5.96%，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說(shuō)明黃芪扶正湯6g/L可誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理人TPC-1細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡流式圖

圖5 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理人TPC-1細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖

2.4 黃芪扶正湯對(duì)人TPC-1細(xì)胞Rb及CDK4 mRNA結(jié)果分析表達(dá)的影響 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組(0g/L)和實(shí)驗(yàn)組(6g/L)細(xì)胞CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000 00±0.080 32，0.132 43±0.019 42；Rb mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000 00±0.056 35，0.148 43±0.019 29。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Rb mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；說(shuō)明黃芪扶正湯6g/L干預(yù)細(xì)胞后，可下調(diào)細(xì)胞CDK4及Rb mRNA表達(dá)。見(jiàn)圖6。

圖6 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CDK4及Rb mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖/分裂是由細(xì)胞周期蛋白及其催化的CDKs緊密調(diào)控，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白CDK4/6形成Cyclin-CDK復(fù)合物，在細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶活化激酶(CAK)的協(xié)同作用下，使其下游的Rb磷酸化，從而解除對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子E2F-1的抑制效應(yīng)，啟動(dòng)DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。CyclinD1-CDK4/CDK6-pRb-E2F-1途徑是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)增殖及細(xì)胞周期的一條重要信號(hào)通路，該途徑任何成分的改變都足以破壞其正常的調(diào)節(jié)功能[6]。細(xì)胞周期蛋白失調(diào)常見(jiàn)于癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心臟病等多種病理狀態(tài)[7]，由于這些原因，我們可以用CDK4 -Rb-E2F- 1通路來(lái)作為黃芪扶正湯治療甲狀腺乳頭狀癌的靶點(diǎn)。臨床研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺腫瘤患者通常伴有免疫功能低下，免疫功能越低，患者預(yù)后越差，也是引起患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要因素。因此如何提高甲狀腺腫瘤患者術(shù)后的免疫功能并且改善其生活質(zhì)量成為臨床研究面對(duì)的重點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，中醫(yī)藥逐漸成為抗腫瘤綜合治療方案中的重要組成部分。中醫(yī)理論認(rèn)為，甲狀腺癌屬中醫(yī)學(xué)“癭瘤”“石癭”范疇；情志內(nèi)傷、飲食失宜是導(dǎo)致甲狀腺癌的兩大主要病因，氣滯、痰凝、血瘀壅結(jié)頸前是癭病的基本病機(jī)；本病初期多為氣機(jī)郁滯，津凝痰聚，痰氣搏結(jié)頸前，日久則可引起血脈瘀阻，進(jìn)而氣、痰、瘀三者合而為患。但是手術(shù)治療耗氣傷血，甲狀腺癌患者手術(shù)治療后，氣、血、津液耗傷，可造成全身虛弱的狀態(tài)[10]。中醫(yī)治療的原則為益氣養(yǎng)陰，扶正固本，解毒散結(jié),滋養(yǎng)肝腎[11]。黃芪扶正湯作為我國(guó)中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方劑，主要由黃芪、黃精、靈芝、女貞子以及枸杞等組成，黃芪歸肝、脾、腎經(jīng)，能健脾益氣，固表排毒，斂瘡生肌；黃精能益氣滋陰，潤(rùn)肺，補(bǔ)肝益腎，抗衰老；靈芝能滋肝補(bǔ)腎，健脾益氣，養(yǎng)心安神，化瘀祛痰，女貞子能滋陰補(bǔ)腎，清肝明目，扶正固本；枸杞能補(bǔ)肝益腎，扶正固本，滋陰補(bǔ)血，生津止渴[12]。

黃芪扶正湯對(duì)甲狀腺癌術(shù)后免疫功能的改善見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)細(xì)胞分子生物學(xué)方面研究報(bào)道較少。本研究中，IC50評(píng)價(jià)檢測(cè)出黃芪扶正湯最優(yōu)有效濃度為6.118g/L，同時(shí)結(jié)果顯示，其可抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低Rb及CDK4 mRNA表達(dá)水平，提示黃芪扶正湯抑制人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡的作用可能與調(diào)控Rb-CDK4通路有關(guān)，這與 Lee HJ[13]等研究結(jié)果一致，其分析CDK4/6雙選擇性抑制劑Ribociclib(LEE011)是通過(guò)抑制CDK4/6，同時(shí)抑制Rb的磷酸化及引起Rb的降解使總Rb降低，誘導(dǎo)ATC細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制ATC細(xì)胞增殖。研究[14]顯示，黃芪有效成分芒柄花素與黃芪甲苷Ⅳ通過(guò)調(diào)控蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人食道癌HCE-4 細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示靈芝和女貞子對(duì)腫瘤細(xì)胞亦有抑制作用，林曉萌等[15]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝有效成分靈芝酸A可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人炎性乳腺癌SUM149細(xì)胞增殖。魏祥燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，可增強(qiáng)小鼠的免疫細(xì)胞的活性和增殖能力，對(duì)卵巢癌治療有一定價(jià)值。黃梓培等[17]研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能緩解正己烷引起的大鼠卵巢組織的氧化應(yīng)激，拮抗Nrf2及下游Ⅱ相解毒酶的活化。秦臻等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃精具有補(bǔ)腎精、強(qiáng)骨髓、調(diào)五臟、抗衰老的功效，黃精可通過(guò)抑制 DNA 損傷檢測(cè)點(diǎn) ATM/ATR 通路的活化來(lái)調(diào)節(jié) EPCs 的細(xì)胞周期，干預(yù) EPCs 的老化進(jìn)程。以上說(shuō)明黃芪扶正湯對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的機(jī)制是多靶點(diǎn)多途徑的復(fù)雜過(guò)程，本研究顯示黃芪扶正湯通過(guò)降低人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1的Rb及CDK4 mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡只是其作用機(jī)制的一個(gè)方面，其他方面的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)Laura L等[19]通過(guò)CDK4/6抑制劑治療乳腺癌和脂肪肉瘤的療效研究指出，CyclinD/CDK4/6抑制劑的CDK4(Ink4)/Rb信號(hào)通路在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，選擇性CDK4/6抑制劑對(duì)多種腫瘤具有較高的治療潛力。

綜上所述，黃芪扶正湯可有效下調(diào)Rb及CDK4 mRNA的表達(dá)水平，引起甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于本實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限，只選擇6g/L作為實(shí)驗(yàn)組研究，尚未深入研究黃芪扶正湯對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1的增殖抑制作用是否有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，且未行WB檢測(cè)Rb及CDK4蛋白水平，這都有待下一步的深入研究。同時(shí)由于細(xì)胞周期的調(diào)控是極其精細(xì)、復(fù)雜的過(guò)程，本研究?jī)H是體外實(shí)驗(yàn)，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證。