Tween 80作用下芘降解細(xì)菌Pyr9在三葉草中的定殖及效能

陳志高，顧玉駿，張海麗，劉娟，高彥征

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是環(huán)境中廣泛存在的一類持久性有毒有害有機(jī)污染物，主要由煤、石油、木材、有機(jī)高分子化合物等有機(jī)物在不完全燃燒或高溫（＞700 ℃）處理?xiàng)l件下產(chǎn)生[1-2]。2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》指出，我國(guó)土壤PAHs 總超標(biāo)率為1.4%，說(shuō)明我國(guó)土壤存在一定的PAHs 污染。PAHs 的強(qiáng)疏水性和脂溶性導(dǎo)致其容易吸附在土壤等固體顆粒物表面[3-4]。進(jìn)入土壤中的PAHs 易被植物吸收積累，并可通過(guò)食物鏈傳遞和富集，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成一定的危害[5]。調(diào)控植物對(duì)土壤中PAHs 的吸收作用，進(jìn)而減低作物PAHs 污染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于在PAHs 污染區(qū)生產(chǎn)安全的農(nóng)產(chǎn)品意義重大。

研究發(fā)現(xiàn)，一些表面活性劑對(duì)PAHs 有增溶作用，可用于調(diào)控植物對(duì)PAHs 的吸收和積累。Gao 等[6]研究顯示，添加適量濃度的月桂醇聚氧乙烯醚（Brij35）（≤74 mg·L-1）可提高菲和芘的溶解度，促進(jìn)植物對(duì)菲和芘的吸收；而高濃度的Brij35（≥148 mg·L-1）可與菲和芘產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，并對(duì)植物有一定的毒害作用，抑制植物的吸收。Liao等[7]研究指出，向土壤中添加適量表面活性劑可以增加PAHs 的解吸率，提高PAHs的生物可利用性，并促進(jìn)玉米對(duì)PAHs的吸收積累。此外，表面活性劑還可以強(qiáng)化微生物-植物聯(lián)合作用對(duì)土壤中PAHs 的去除。研究表明，添加生物表面活性劑鼠李糖脂和大豆卵磷脂，不僅可以顯著提高根際土壤中微生物數(shù)量和總石油烴的生物可利用性，還促進(jìn)了植物根系對(duì)總石油烴的吸收積累和微生物降解[8]。Ni 等[9]的研究也表明，與不添加表面活性劑相比，添加表面活性劑Tween 80 提高了植物與微生物聯(lián)合作用對(duì)土壤中菲和芘的去除率，分別提高了49.8%和48.1%。

除表面活性劑外，在植物根際或體內(nèi)定殖功能微生物，也可有效控制植物對(duì)PAHs 的吸收和積累[10-11]。Sun 等[12]從生長(zhǎng)于PAHs 污染區(qū)的健康植物體內(nèi)分離出一株芘降解內(nèi)生細(xì)菌Staphylococcussp.BJ06，該菌能良好定殖于植物根際、根內(nèi)和莖葉內(nèi)，并可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和芘的代謝；相比不接菌植物，接菌植物根部和莖葉部芘的含量分別降低了31.01%和44.22%。Lenoir 等[13]研究表明，叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在植物根部形成的菌根可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)根際PAHs 等持久性有機(jī)污染物的吸收和去除；此外，AMF 還可引起植物根系分泌物濃度和成分的改變，吸引根際微生物在植物根表大量聚集，其中不乏PAHs 降解菌[14]。另外，有些AMF自身含有過(guò)氧化物酶等酶系[15]，可直接降解PAHs 等有機(jī)污染物。然而，有關(guān)表面活性劑對(duì)降解細(xì)菌在植物體內(nèi)定殖和分布的影響知之甚少，有關(guān)表面活性劑作用下降解細(xì)菌的定殖對(duì)植物吸收積累PAHs 的影響也尚不可知。

基于此，本研究擬以非離子型表面活性劑Tween 80、芘降解細(xì)菌Pyr9 和三葉草作為供試對(duì)象，采用溫室土培實(shí)驗(yàn)，研究不同劑量Tween 80 作用下Pyr9 在三葉草根際和體內(nèi)的定殖與分布情況，并探討Tween 80 作用下Pyr9 的定殖對(duì)三葉草吸收芘的影響。研究結(jié)果有望初步闡明表面活性劑作用下植物來(lái)源的降解細(xì)菌在植物中的定殖和效能，為在PAHs 污染區(qū)生產(chǎn)安全的農(nóng)產(chǎn)品提供理論依據(jù)，也為PAHs 污染土壤的“邊修復(fù)邊生產(chǎn)”提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：芘降解細(xì)菌Mycobacteriumsp.Pyr9，屬環(huán)境分枝桿菌，具有氨芐青霉素和氯霉素抗性，分離于PAHs 污染區(qū)植物牛筋草[Eleusine indica（L.）Gaertn.]根表，保存于本實(shí)驗(yàn)室-70 ℃冰箱。

植物：三葉草，品種為白車軸草（Trifolium repensL.），其種子購(gòu)自江蘇農(nóng)科種業(yè)研究院有限公司。

芘（Pyrene，純度≥98%）購(gòu)自德國(guó)Fluka 公司，其相對(duì)分子量為202.26，25 ℃純水中溶解度為0.12 mg·L-1，辛醇-水分配系數(shù)（logKow）為5.18，其溶液以丙酮為溶劑配制；甲醇、乙腈和丙酮為色譜純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司；聚氧乙烯（20）失水山梨醇單油脂肪酸（Tween 80），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

LB 培養(yǎng)基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：（NH4）2SO41.50 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.91 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，KH2PO40.50 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.20 g·L-1，微量元素溶液2 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。微量元素溶液：CoCl2·6H2O 0.1 g·L-1，MnCl2·4H2O 0.425 g·L-1，ZnCl20.05 g·L-1，NiCl2·6H2O 0.01 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.015 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，Na2SeO4·2H2O 0.01 g·L-1。芘降解培養(yǎng)基（PMM）：2 g·L-1的芘丙酮溶液過(guò)0.22μm 濾膜除菌，取一定量置于滅菌的三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后加入滅菌的MSM，使芘的最終濃度達(dá)到50 mg·L-1。若制備固體培養(yǎng)基，則向上述液體培養(yǎng)基中加入18 g·L-1的瓊脂。滅菌條件：溫度121 ℃，時(shí)間20 min。

1.2 細(xì)菌Pyr9以芘為碳源的生長(zhǎng)與降解曲線測(cè)定

向無(wú)菌的50 mL 玻璃三角瓶中加入一定量芘丙酮母液，待丙酮揮發(fā)后加入滅菌的20 mL 無(wú)機(jī)鹽溶液，使芘的濃度為50 mg·L-1（丙酮含量＜0.5%），再以2%的接種量加入菌株P(guān)yr9 的新鮮菌懸液（OD600nm=1.0，對(duì)照組加等量滅活菌懸液）；處理組和對(duì)照組皆設(shè)置8 個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 個(gè)重復(fù)，共48 個(gè)三角瓶，于30 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為14 d；期間每2 d同一時(shí)間取出每組設(shè)置的3個(gè)三角瓶，加入2 倍體積的甲醇，超聲30 min 后靜置2 h，取適量溶液過(guò)0.22μm 孔徑的有機(jī)相濾膜，裝于液相瓶中，保存于-20 ℃冰箱，待測(cè)定[12]。同時(shí)，在加入甲醇之前，將搖瓶中培養(yǎng)基搖勻后取0.5 mL 培養(yǎng)液，采用梯度稀釋涂布平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[12]，并以此計(jì)算培養(yǎng)液中細(xì)菌Pyr9的數(shù)量。

培養(yǎng)液中芘的含量用島津LC-20AT 高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定[16]，其檢測(cè)條件為：色譜柱為Φ4.6 mm×250 mm 烷基C18 反相柱；流動(dòng)相為甲醇/水（V∶V=90∶10），流速1 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)時(shí)間8 min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3 供試土壤的采集和處理

供試土壤取自南京某農(nóng)田表層土壤（0～20 cm），類型為黃棕壤，其中PAHs未檢出。土壤pH 6.03，有機(jī)碳含量14.3 g·kg-1。土樣采集后，風(fēng)干，過(guò)10目篩；取少量風(fēng)干土壤添加適量含芘的丙酮溶液，充分混合均勻；待丙酮完全揮發(fā)后，將含芘的風(fēng)干土壤與剩余風(fēng)干土壤充分混合均勻。其中芘的添加量參考研究組之前調(diào)查的長(zhǎng)三角地區(qū)石化廠周邊PAHs重污染區(qū)表層土壤中的實(shí)際PAHs 總含量。稱取300 g 上述土樣于盆缽中，在50%田間持水量下平衡老化60 d 后待用。測(cè)得土壤中芘的初始含量為7.86 mg·kg-1。

1.4 盆栽實(shí)驗(yàn)設(shè)置

三葉草種子經(jīng)10%雙氧水浸泡消毒5 min 后立即用無(wú)菌水沖洗[17]，在蛭石中催芽至10 cm 后移栽至污染土壤中，每盆留苗12株。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：空白對(duì)照組（CK），污染土壤；種植植物組（CP），污染土壤+三葉草；接菌組（CB），污染土壤+Pyr9；灌根組（CPR），污染土壤+三葉草+Pyr9灌根。CPR 是于移栽后取10 mL Pyr9 菌懸液（OD600nm=1.0）均勻灌溉于三葉草根部，CP 以滅活的菌液做相同處理，CB 為同時(shí)取10 mL 菌懸液均勻灌溉于土壤中。移栽植物3 d后向各處理土壤中施入不同濃度的Tween 80 溶液，其終濃度設(shè)置為：0、100、250、500、1 000 mg·kg-1干土。每個(gè)處理設(shè)置3 組重復(fù)。試驗(yàn)期間設(shè)定溫度為白天25 ℃，夜晚20 ℃。植物生長(zhǎng)過(guò)程中定期澆水，每2 d 隨機(jī)交換盆缽的位置。為了及時(shí)檢測(cè)細(xì)菌Pyr9 在土壤-三葉草中的分布，灌根處理10 d后即采集土壤和三葉草樣品，檢測(cè)其中的芘含量和Pyr9數(shù)量。

1.5 三葉草生物量的測(cè)定

收集培育好的新鮮植物樣，用滅菌毛刷輕輕擦去根部土壤，再用無(wú)菌水沖洗植株至少3 min，將植株根系和莖葉表面附著物全部沖洗干凈后，用吸水紙吸干植株表面水分。將三葉草根和莖葉分開(kāi)，用萬(wàn)分之一分析天平分別稱量其鮮質(zhì)量，并記錄數(shù)據(jù)。

1.6 根際土壤和三葉草中功能細(xì)菌Pyr9的數(shù)量測(cè)定

菌株P(guān)yr9 具有氨芐青霉素和氯霉素抗性，且在芘降解平板上可形成降解圈，以這些特征作為標(biāo)記對(duì)定殖在土壤和植物中的菌株P(guān)yr9 進(jìn)行計(jì)數(shù)。取5.0 g根際土壤，置于裝有45 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，內(nèi)置玻璃珠數(shù)顆，于搖床220 r·min-1振蕩10 min 后，立即吸取土壤懸液梯度稀釋并涂布于含有氨芐青霉素（75 mg·L-1）和氯霉素（25 mg·L-1）的芘降解固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，于紫外燈下觀察菌株P(guān)yr9生成的降解圈，并對(duì)菌株P(guān)yr9 進(jìn)行計(jì)數(shù)，以計(jì)算每克土壤中的細(xì)菌Pyr9數(shù)量。為防止將其他細(xì)菌計(jì)入其中，隨機(jī)挑取平板上生成降解圈的菌株進(jìn)行16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序[10]，確定其為細(xì)菌Pyr9。三葉草生物量測(cè)定后，將其根和莖葉分開(kāi)，分別取適量樣品置于無(wú)菌研缽中，添加無(wú)菌水研磨成懸液，按上述方法對(duì)定殖于三葉草中的菌株P(guān)yr9進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 土壤和三葉草中芘含量的測(cè)定

1.7.1 土壤中芘含量的測(cè)定

取一定量冷凍干燥后的土樣置于研缽中，充分磨碎后過(guò)20 目篩，取2 g 上述土樣于玻璃離心管中，加入10 mL 體積比為1∶1 的二氯甲烷與正己烷的混合液，蓋緊蓋子后超聲萃取1 h，以4 000 r·min-1的速度離心10 min，再取5 mL上清液過(guò)2 g-2 g無(wú)水硫酸鈉-硅膠柱，并用10 mL 體積比為1∶1 的二氯甲烷和正己烷溶液洗脫，將洗脫液收集至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，40 ℃恒溫下濃縮至干，用甲醇定容到2 mL，過(guò)0.22 μm 孔徑濾膜后，用HPLC/UV檢測(cè)分析[18]。

1.7.2 三葉草中芘含量的測(cè)定

將植物的根和莖葉用剪刀剪斷，分裝于自封袋中，置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥2～3 d，將冷凍干燥后的植物根和莖葉用研缽充分研磨粉碎，然后稱取一定量植物樣于30 mL玻璃離心管中，再加入10 mL二氯甲烷和正己烷（V∶V=1∶1）的混合溶液超聲萃取30 min，重復(fù)3次[19]。按照1.7.1的方法進(jìn)行三葉草中芘含量測(cè)定。

1.8 芘在三葉草中的富集和轉(zhuǎn)移系數(shù)計(jì)算

三葉草中芘富集系數(shù)（Plant concentration factor，PCF）的計(jì)算方式為[12]：

式中：Cp表示三葉草中芘的含量，mg·kg-1；Cs表示土壤中芘的含量，mg·kg-1。

三葉草中芘轉(zhuǎn)移系數(shù)（Translocation factor，TF）的計(jì)算方式為[12]：

TF=SCF/RCF

式中：SCF 表示芘在三葉草莖葉中的富集系數(shù)；RCF表示芘在三葉草根中的富集系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 以芘為碳源的細(xì)菌Pyr9生長(zhǎng)曲線與芘降解曲線

菌株P(guān)yr9 的生長(zhǎng)和芘降解曲線如圖1 所示，經(jīng)過(guò)2 d 的適應(yīng)期后，菌株P(guān)yr9 進(jìn)入快速代謝芘的階段，同時(shí)菌株數(shù)量快速增加。當(dāng)培養(yǎng)至第10 d 時(shí)，菌株P(guān)yr9 對(duì)芘的降解率已在95%以上，同時(shí)菌株到達(dá)穩(wěn)定期；而相同時(shí)間內(nèi)添加了等量滅活菌株的對(duì)照組中芘濃度因非生物因素僅降低了8.64%，這表明細(xì)菌Pyr9 對(duì)芘有良好的降解能力。在10～12 d 時(shí)，殘留的芘進(jìn)一步被代謝完全，菌株P(guān)yr9 則停止增殖，其數(shù)量略有下降。

圖1 以芘為碳源的芘降解曲線和菌株P(guān)yr9生長(zhǎng)曲線Figure 1 The pyrene-degrading and Pyr9 growth curve of strain Pyr9 with pyrene as the carbon source

2.2 不同添加量Tween 80 作用下細(xì)菌Pyr9 在土壤和三葉草中的定殖和分布

不同添加量Tween 80 作用下菌株P(guān)yr9 在土壤和三葉草中的數(shù)量變化如表1 所示。當(dāng)Tween 80 添加量在100～500 mg·kg-1范圍時(shí)，CB 組和CPR 組土壤中Pyr9 的數(shù)量皆略高于未添加Tween 80 處理；而當(dāng)Tween 80 添加量為1 000 mg·kg-1時(shí)，CB 組土壤中Pyr9的數(shù)量有所下降。隨著Tween 80添加量的增長(zhǎng)，定殖在三葉草根部和莖葉部的Pyr9 數(shù)量也呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，其中100 mg·kg-1的Tween 80 最有利于菌株P(guān)yr9的定殖和生長(zhǎng)。與土壤中類似，當(dāng)Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時(shí)，定殖在三葉草體根部和莖葉部的Pyr9數(shù)量開(kāi)始下降。

2.3 不同劑量Tween 80 的添加和細(xì)菌Pyr9 的定殖對(duì)三葉草生長(zhǎng)的影響

不同劑量Tween 80 的添加和細(xì)菌Pyr9 的定殖對(duì)三葉草根部和莖葉部生物量（鮮質(zhì)量）的影響如圖2所示。在供試Tween 80 劑量范圍內(nèi)，CP 組和CPR 組三葉草根部和莖葉部的生物量隨Tween 80 含量的增加呈逐漸減少的趨勢(shì)。如當(dāng)Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時(shí)，CP 組三葉草根部和莖葉部的生物量（455 mg 和1 353 mg）較不添加Tween 80 對(duì)照組三葉草根部和莖葉部的生物量（583 mg 和1 607 mg）分別減少了22%和16%。菌株P(guān)yr9 的定殖在不同Tween 80 添加劑量下均可顯著提高三葉草的生物量（P＜0.05）。如當(dāng)Tween 80 含量為500 mg·kg-1時(shí)，CPR 組三葉草根部的生物量（632 mg）比CP 組（503 mg）提高了26%，而莖葉部生物量（1 719 mg）則比CP 組（1 424 mg）提高了21%。

表1 土壤和三葉草中定殖的菌株P(guān)yr9數(shù)量（log CFU·g-1 FW）Table 1 The cell counts of strain Pyr9 colonized in soil and white clover（log CFU·g-1 FW）

圖2 不同Tween 80添加量下三葉草的生物量Figure 2 The biomass of the white clover under different Tween 80 contents

2.4 不同劑量Tween 80 的添加和細(xì)菌Pyr9 的定殖對(duì)三葉草吸收積累芘的影響

不同劑量Tween 80 的添加和細(xì)菌Pyr9 的定殖對(duì)三葉草根部和莖葉部吸收積累芘的影響如圖3 所示。隨著Tween 80 添加量的增加，三葉草根部和莖葉部的芘含量整體呈上升趨勢(shì)。Tween 80 含量在0～250 mg·kg-1時(shí)，三葉草中的芘含量上升迅速，Tween 80 含量在250～1 000 mg·kg-1時(shí)，其上升相對(duì)平緩。不添加Tween 80 時(shí)，CP 組三葉草根部和莖葉部的芘含量分別為1.99 mg·kg-1和0.84 mg·kg-1，而添加250 mg·kg-1Tween 80 時(shí)其根部和莖葉部的芘含量分別為2.52 mg·kg-1和1.13 mg·kg-1，與不添加Tween 80 對(duì)照組相比分別提高了27% 和35%；而當(dāng)Tween 80 含量為1 000 mg·kg-1時(shí)，CP組三葉草根部和莖葉部的芘含量分別為2.66 mg·kg-1和1.10 mg·kg-1，與不添加Tween 80對(duì)照組相比分別提高了34%和31%。

菌株P(guān)yr9 在三葉草中的定殖能顯著降低三葉草體內(nèi)的芘含量（P＜0.05），且添加Tween 80可增強(qiáng)菌株P(guān)yr9 的作用效果。當(dāng)不添加Tween 80 時(shí)，CP 組和CPR 組三葉草根部芘含量分別為1.99 mg·kg-1和1.83 mg·kg-1，莖葉部芘含量分別為0.84 mg·kg-1和0.76 mg·kg-1；與CP組相比，CPR組三葉草根部和莖葉部芘含量分別降低了8.0% 和9.5%。在Tween 80 添加量為500 mg·kg-1時(shí)，CP 組三葉草根部和莖葉部芘含量分別為2.44 mg·kg-1和1.16 mg·kg-1，此時(shí)CPR 組三葉草根部和莖葉部芘含量分別為1.98 mg·kg-1和0.92 mg·kg-1，與CP 組相比分別降低了19%和21%。以上結(jié)果表明，相較于細(xì)菌Pyr9 的單獨(dú)作用，添加適量Tween 80 和細(xì)菌Pyr9 共同作用對(duì)于降低植物體內(nèi)的芘含量效果更為顯著（P＜0.05）。

圖3 不同Tween 80添加量下三葉草中的芘含量Figure 3 The contents of pyrene in the white clover under different Tween 80 contents

2.5 不同添加量Tween 80 作用下細(xì)菌Pyr9 和三葉草共同作用對(duì)根際土壤中芘的去除

不同添加量Tween 80 處理下土壤中的芘殘留含量如圖4所示。從圖中可以看出，在0～500 mg·kg-1范圍內(nèi)，隨著Tween 80 含量的增加，土壤中的芘含量呈逐漸降低的趨勢(shì)。Tween 80添加量為500 mg·kg-1時(shí)，CK 組土壤中芘含量為2.78 mg·kg-1，而不添加Tween 80 的CK 組為4.28 mg·kg-1，前者與后者相比土壤中的芘含量降低了35%。相較之下，Tween 80添加量為1 000 mg·kg-1時(shí)，CK 組土壤中的芘含量（3.54 mg·kg-1）不再繼續(xù)減少，反而有所增高，但仍低于不添加Tween 80的CK組（4.28 mg·kg-1）。

圖4 不同Tween 80添加量下土壤中的芘含量Figure 4 The pyrene residues in soils under different Tween 80 contents

對(duì)相同劑量Tween 80 處理下CP 組、CB 組與CPR組土壤中芘的殘留量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CPR組的芘含量要顯著低于CP 組和CB 組（P＜0.05）。如當(dāng)Tween 80添加量為100 mg·kg-1時(shí)，CP 組、CB 組和CPR 組土壤中芘的殘留量分別為3.37、3.64、2.94 mg·kg-1，CPR 組比CP組和CB組分別降低了13%和19%，這表明相對(duì)于三葉草或菌株P(guān)yr9的單獨(dú)作用，三葉草和菌株P(guān)yr9的共同作用對(duì)土壤中芘的去除效果更佳。當(dāng)Tween 80 添加量為500 mg·kg-1時(shí)，CPR 組土壤中芘的殘留量為2.17 mg·kg-1，與不添加Tween 80 的CK 組（4.28 mg·kg-1）相比降低了49%。綜上所述，添加適量Tween 80 有助于提高三葉草和菌株P(guān)yr9 共同作用下對(duì)土壤中芘的去除。

為了及時(shí)檢測(cè)功能細(xì)菌Pyr9 在根際土壤和三葉草中的分布，盆栽培養(yǎng)10 d后即采樣檢測(cè)了根際土壤和三葉草體內(nèi)的芘含量，此時(shí)Tween 80-細(xì)菌Pyr9-三葉草共同作用對(duì)土壤中芘的去除并不徹底；若培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，該體系下的芘污染最終應(yīng)該會(huì)被徹底消除。

2.6 不同劑量Tween 80-細(xì)菌Pyr9 共同作用下芘在三葉草中的富集和轉(zhuǎn)移系數(shù)

進(jìn)一步計(jì)算了不同Tween 80 添加量下三葉草對(duì)土壤中芘的富集系數(shù)以及芘在三葉草中的轉(zhuǎn)移系數(shù)，結(jié)果如表2 所示。添加不同劑量Tween 80 均使三葉草中芘的富集系數(shù)顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明Tween 80促進(jìn)了三葉草對(duì)土壤中芘的富集作用，增強(qiáng)了其芘污染風(fēng)險(xiǎn)；而接種功能細(xì)菌Pyr9 可在一定程度上降低這種風(fēng)險(xiǎn)。隨著Tween 80 添加量的增加，三葉草中的芘富集系數(shù)整體呈先升后降的趨勢(shì)；Tween 80添加量為500 mg·kg-1時(shí)，三葉草根部和莖葉部的芘富集系數(shù)最高。相較而言，芘在三葉草中的轉(zhuǎn)移系數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，在Tween 80 添加量改變或是否接種功能菌株P(guān)yr9情況下的變化不大，說(shuō)明芘從三葉草根部向莖葉部的轉(zhuǎn)移受Tween 80或功能細(xì)菌Pyr9的影響不大。

表2 不同Tween 80添加量下三葉草對(duì)土壤中芘的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 2 The PCF and TF of pyrene in the white clover under different Tween 80 contents

3 討論

相比于陰離子和陽(yáng)離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑具有低毒性、易被生物降解的特點(diǎn)[20]；Tween 80作為典型的非離子型表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于土壤PAHs的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，中低劑量的Tween 80（≤500 mg·kg-1）可以促進(jìn)降解細(xì)菌Pyr9 在土壤中的定殖和生長(zhǎng)，而高劑量的Tween 80（1 000 mg·kg-1）則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。這可能是由于低劑量的Tween 80促進(jìn)了土壤中芘的溶出[22]，增加了芘的生物可利用性[23-24]，進(jìn)而促進(jìn)了Pyr9 的增殖[7]；而高劑量的Tween 80 對(duì)Pyr9 有毒害作用，抑制了其增殖[25]。定殖于三葉草中的Pyr9的數(shù)量變化規(guī)律與土壤中類似，Tween 80 含量為100 mg·kg-1時(shí)其數(shù)量最高，在土壤中則是Tween 80 含量為500 mg·kg-1時(shí)其數(shù)量最高。造成這種差異的原因可能是高劑量Tween 80對(duì)植物根部有損害[7]，不利于菌株P(guān)yr9 從三葉草根際向體內(nèi)的遷移。此外，高劑量的Tween 80（500～1 000 mg·kg-1）顯著抑制了三葉草的生長(zhǎng)。推測(cè)原因，一方面是因?yàn)門ween 80對(duì)植物根部細(xì)胞有毒害作用[26]，劑量越高，其對(duì)植物的毒害作用越大；另一方面，高劑量Tween 80促進(jìn)了土壤中芘的溶出，從而增強(qiáng)了芘對(duì)植物的脅迫作用。而細(xì)菌Pyr9 的定殖則使三葉草的生長(zhǎng)抑制顯著減低，這是由于Pyr9本身具備的產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)鐵載體以及溶磷能力促進(jìn)了三葉草的生長(zhǎng)；同時(shí)菌株P(guān)yr9 可快速降解三葉草根際和體內(nèi)的芘，緩解了高濃度芘對(duì)三葉草的生長(zhǎng)脅迫作用。

添加適量Tween 80 可提高土壤中PAHs 等有機(jī)污染物的溶解性和生物可利用性，使其更容易被植物吸收或被微生物降解[26-27]。在本研究中，添加不同劑量Tween 80 均促進(jìn)了三葉草對(duì)芘的吸收，且當(dāng)Tween 80 含量在0～250 mg·kg-1時(shí)，三葉草中的芘含量隨Tween 80含量增加上升迅速。此外，隨著Tween 80含量的增加，土壤中的芘含量先減少后增加，說(shuō)明高濃度Tween 80（1 000 mg·kg-1）不利于土壤中芘的去除。眾多研究也證實(shí)[20-21，28]，添加適量的Tween 80 能顯著提高PAHs 的生物降解率；而過(guò)量添加Tween 80 雖可促進(jìn)土壤中PAHs 的解吸并提高PAHs 的溶解性，但會(huì)抑制PAHs 的生物降解過(guò)程。其原因有以下三點(diǎn)：（1）PAHs與Tween 80膠束結(jié)合，反而降低了其生物有效性[29]；（2）高濃度的Tween 80會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[30]；（3）Tween 80 作為碳源和能源優(yōu)先被微生物利用[31]。

PAHs降解細(xì)菌在根際土壤和植物中的定殖能有效減低植物體內(nèi)的PAHs 含量，降低其PAHs 污染風(fēng)險(xiǎn)[12]。在本研究中，相比于不接種Pyr9 的三葉草，接菌處理的三葉草根部和莖葉部芘含量顯著降低，芘富集系數(shù)也明顯下降。研究表明，植物根際和體內(nèi)存在數(shù)量可觀的PAHs 降解細(xì)菌，可用于植物-微生物聯(lián)合作用修復(fù)PAHs 污染[32-33]。在根際微生態(tài)環(huán)境中，植物根系分泌物（糖類、有機(jī)酸和氨基酸等）可為根際細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且吸引根際細(xì)菌在植物根表定殖形成聚集體或細(xì)菌生物膜。根際細(xì)菌則可通過(guò)產(chǎn)生促生物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，或是通過(guò)降解PAHs 等有機(jī)污染物提高植物對(duì)污染環(huán)境的抗逆性[32，34]。此外，一些定殖在植物根表的PAHs 降解細(xì)菌還可進(jìn)入植物體內(nèi)成為內(nèi)生細(xì)菌，直接降解植物體內(nèi)的PAHs，或是誘導(dǎo)植物體內(nèi)的PAHs 代謝酶系，加速植物體內(nèi)PAHs 的去除[35]。另外，功能內(nèi)生細(xì)菌也可通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移將自身的PAHs 降解基因轉(zhuǎn)移給其他植物內(nèi)生細(xì)菌[36]，以加速植物體內(nèi)PAHs 的降解，減少PAHs在植物組織中的積累。

目前已有的研究多是關(guān)注Tween 80 等表面活性劑對(duì)植物吸收代謝PAHs 或微生物降解PAHs 的影響，有關(guān)表面活性劑對(duì)降解細(xì)菌在植物根際和體內(nèi)的定殖、分布以及效能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)溫室土培實(shí)驗(yàn)，研究了0～1 000 mg·kg-1的Tween 80作用下細(xì)菌Pyr9 在三葉草根部的定殖和分布以及對(duì)三葉草吸收累積芘的影響，獲得了一些初步的結(jié)果，為保障PAHs 污染區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全提供了理論依據(jù)。但本研究尚有幾點(diǎn)不足之處，在此說(shuō)明，并建議作為后續(xù)研究的關(guān)注點(diǎn)：（1）盆栽實(shí)驗(yàn)所采用的PAHs 為單一芘污染，而實(shí)際環(huán)境中多為多種PAHs 復(fù)合污染，且濃度差異較大，在這種復(fù)雜的環(huán)境中應(yīng)用該技術(shù)效果如何尚不可知；（2）為了及時(shí)追蹤菌株P(guān)yr9 在三葉草中的定殖和分布，三葉草植株的整體培養(yǎng)時(shí)間較短，后續(xù)可開(kāi)展不同培養(yǎng)時(shí)間的連續(xù)采樣檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)各個(gè)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化；（3）不同劑量Tween 80 對(duì)植物根際和體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)以及PAHs 代謝酶系活性的影響未做探討。完成以上幾個(gè)方面的研究，方可全面深入地闡述Tween 80-植物-微生物-PAHs 之間的相互關(guān)系。

4 結(jié)論

（1）低劑量（100 mg·kg-1）的Tween 80可促進(jìn)菌株P(guān)yr9在三葉草中的定殖和生長(zhǎng)，且對(duì)三葉草的生長(zhǎng)影響不大。

（2）高劑量（≥500 mg·kg-1）的Tween 80 可抑制三葉草的生長(zhǎng)，而菌株P(guān)yr9 的定殖則可促進(jìn)三葉草的生長(zhǎng)。

（3）適當(dāng)劑量Tween 80（100～500 mg·kg-1）的施用可有效促進(jìn)菌株P(guān)yr9降解三葉草中的芘。