尋常型天皰瘡信號通路研究進(jìn)展

謝志敏， 潘喬林， 沈旭成， 張怡， 葉興東,2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所，廣東 廣州 510182；2.廣州市皮膚病防治所皮膚科，廣東 廣州 510095)

天皰瘡(pemphigus)是一種罕見的慢性自身免疫性大皰性皮膚病, 典型臨床表現(xiàn)為紅斑基礎(chǔ)上松弛性水皰、皮膚粘膜糜爛難愈、伴污穢性結(jié)痂、皮膚Nikolsky陽性，病理表現(xiàn)為棘層松解伴表皮內(nèi)水皰。其發(fā)病機(jī)制為患者血循環(huán)中產(chǎn)生針對角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)橋粒芯蛋白(desmoglein, Dsg)的自身抗體IgG，自身抗體結(jié)合到表皮細(xì)胞上，攻擊橋粒蛋白，使表皮細(xì)胞間連接消失，導(dǎo)致棘層松解。而尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris, PV)是最常見的天皰瘡類型，占所有天皰瘡的70%。應(yīng)用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑仍是目前首選治療，生物制劑、造血干細(xì)胞移植等新治療手段有望減少激素用量及激素并發(fā)癥[1]。

越來越多的證據(jù)表明自身抗體誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞松解的過程更為復(fù)雜，僅將PV自身抗體與細(xì)胞表面結(jié)合并不足以導(dǎo)致細(xì)胞分離。致病性抗體導(dǎo)致PV棘層松解的機(jī)制有以下原因：①自身抗體結(jié)合導(dǎo)致直接空間位阻；②抗體結(jié)合觸發(fā)信號通路的改變；③橋粒蛋白的耗竭；④其他不明原因，如細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子釋放等。目前認(rèn)為信號通路在PV細(xì)胞黏附消失和水皰形成中起重要作用。天皰瘡抗體與KC結(jié)合，導(dǎo)致KC上活化的絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family, member A，RhoA)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、Src等信號通路的激活。

然而，迄今為止還沒有精確的信號級聯(lián)來描述這些機(jī)制是如何運(yùn)作的。圖1的推測模型展示了各個通路的激活及級聯(lián)，為從信號通路方面解釋天皰瘡的發(fā)病機(jī)制提供了一個框架?，F(xiàn)就上述信號通路對天皰瘡的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行綜述，為天皰瘡的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，同時為尋找有效靶向藥物治療提供新的思路。

1 MAPK的激活是天皰瘡自身抗體結(jié)合的中心信號機(jī)制，與細(xì)胞間黏附的喪失、角蛋白的收縮及細(xì)胞凋亡相關(guān)

MAPK信號通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡中起重要作用，由3個不同的聯(lián)級組成，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-related kinases, ERK)、氨基末端激酶(Jun aminoterminal kinases, JNK)和p38MAPK。

p38MAPK蛋白可以被環(huán)境應(yīng)激激活，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞骨架調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)信號傳導(dǎo)和凋亡通路的激活。熱休克蛋白(heat-shock protein，HSP)27既可以作為分子伴侶調(diào)節(jié)蛋白折疊，也可以調(diào)節(jié)信號通路。p38MAPK和HSP27可以調(diào)節(jié)肌動蛋白和中間絲蛋白，另外p38MAPK介導(dǎo)的HSP27磷酸化也被證實(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。

在PV細(xì)胞模型中，天皰瘡自身抗體與表皮KC的橋粒Dsg3結(jié)合，激活p38MAPK磷酸化，從而導(dǎo)致MAPKAP激酶 2(MAPKAP-kinase 2，MK2)和HSP27的磷酸化，磷酸化水平隨著PV-IgG濃度的增高而增高，最早在30 min內(nèi)達(dá)到峰值[2]，并出現(xiàn)肌動蛋白重組，細(xì)胞角蛋白收縮，同時胞外-胞內(nèi)跨膜信號通路激活，從而導(dǎo)致Dsg3內(nèi)吞及棘層松解[3]。非Dsg自身抗體也可以使p38MAPK磷酸化，釋放細(xì)胞色素C和增加半胱天冬酶(caspase)9的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。在PV組織活檢中同樣可以觀察到磷酸化p38MAPK和磷酸化HSP27的表達(dá)增加[5]。p38MAPK抑制劑SB202190可以阻斷天皰瘡抗體導(dǎo)致的Dsg3耗竭及內(nèi)吞，恢復(fù)因自身抗體和角蛋白缺乏引起的細(xì)胞間粘附的損失、橋粒間隙的增寬[6]，也可以抑制MK2、HSP27及p38MAPK的磷酸化[7]。天皰瘡動物模型中，以SB202190預(yù)處理的小鼠可以避免PV-IgG誘導(dǎo)的水皰形成[5]。

圖1 PV棘層松解過程中主要信號通路圖Fig.1 Diagram of main signaling pathways in PV acantholysis.

MK2的活化與細(xì)胞周期控制、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、角蛋白和肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控有關(guān)。在HaCaT細(xì)胞中，抑制MK2可以阻止PV抗體介導(dǎo)的細(xì)胞表面Dsg3丟失，與p38MAPK抑制劑的作用相當(dāng)；但是在動物模型中，MK2抑制劑不能阻止水皰形成[8]。MK2能被p38MAPK磷酸化而激活，MK2抑制劑可以降低HSP27的磷酸化水平，但不影響上游p38MAPK的磷酸化[8]。這說明MK2是p38MAPK的主要下游效應(yīng)因子，但p38MAPK下游的其他通路可能也參與了PV-IgG導(dǎo)致的棘層松解過程。

JNK磷酸化并調(diào)控c-Jun以外的轉(zhuǎn)錄因子的活性。該通路在細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和遷移中起重要作用。p38MAPK信號通路可被細(xì)胞應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子以類似JNK信號通路的方式刺激，二者均可通過凋亡參與調(diào)控細(xì)胞死亡；執(zhí)行caspases(executioner caspases)抑制劑可以阻斷JNK的活化和晚期p38MAPK的激活，說明這些效應(yīng)是由PV自身抗體引起的細(xì)胞損傷(如細(xì)胞骨架塌陷和橋粒解體)所觸發(fā)[9]。

美國一項(xiàng)使用p38MAPK抑制劑KC-706治療15例PV患者的多中心臨床試驗(yàn)中，一半的患者有部分緩解，其余患者無改善或者病情加重[10]。另一項(xiàng)人體外口腔粘膜培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提示AK23(鼠源性抗Dsg3單克隆抗體)及PV-IgG可以減少唇粘膜橋粒的數(shù)量和大小，導(dǎo)致水皰形成，但加入p38MAPK抑制劑不能阻止水皰形成[11]。盡管目前關(guān)于p38MAPK抑制劑的藥物使用并不成功，p38MAPK仍然是一個可行的治療靶點(diǎn)。

2 EGFR通路通過Src調(diào)節(jié)Dsg3的粘附，與天皰瘡自身抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附喪失相關(guān)

EGFR是上皮組織中廣泛表達(dá)的受體，受特異性配體活化和非特異性配體反活化的影響，參與細(xì)胞增殖、黏附和凋亡等重要細(xì)胞過程的調(diào)控，其功能通過與其他信號通路的交叉通信而增加。EGFR信號已被證明通過調(diào)節(jié)橋粒間黏附狀態(tài)和增殖狀態(tài)從而影響細(xì)胞間黏附[12]。

AK23注射小鼠2 h后觀察到細(xì)胞間橋粒間隙的擴(kuò)大，EGFR的激活，隨后出現(xiàn)Myc表達(dá)增加，Dsg3耗竭及水皰形成[13]。小鼠注射PV-IgG后表皮基底層磷酸化EGFR水平增加；EGFR抑制劑erlotinib預(yù)處理的小鼠可以觀察到細(xì)胞凋亡和棘層松解的抑制[14]。在細(xì)胞模型中，EGFR對PV-IgG的反應(yīng)在30 min后被明顯激活[15]，EGFR抑制劑AG1478可以降低PV-IgG誘導(dǎo)的EGFR自磷酸化、細(xì)胞凋亡和FasL的出現(xiàn)[16]。

Walter等[15]指出PV-IgG以Src依賴方式激活EGFR，EGFR的激活使Dsg3與角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)合從7.67%下降至3.2%，并且這依賴于Ca2+通道，能被Ca2+離子螯合劑所阻斷。PV-IgG作用于KC后，Src的活性在30 min達(dá)到峰值，Src抑制劑可以降低EGFR和p38MAPK的活性[17]，抑制斑菲素蛋白(plakophilins，PKP)3磷酸化[18]。在動物模型中Src抑制劑明顯降低AK23誘導(dǎo)表皮水皰形成，但對PV-IgG誘導(dǎo)的表皮水皰形成沒有保護(hù)作用[19]。此外還發(fā)現(xiàn)抗橋粒膠蛋白(desmocollin，Dsc)3抗體及α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR)可以影響Src的激活[4]。

Heupel等[20]發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)孵育的HaCaT細(xì)胞可以導(dǎo)致細(xì)胞間黏附消失及角蛋白收縮，與PV-IgG的作用結(jié)果類似；但將PV-IgG孵育HaCaT細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PV-IgG既沒有通過酪氨酸Y1173的磷酸化導(dǎo)致EGFR的典型活化，也沒有引起EGFR在c-Src依賴位點(diǎn)Y845的磷酸化。

目前尚不清楚EGFR是如何調(diào)節(jié)橋粒連接的。EGFR通路在天皰瘡細(xì)胞模型中對PV-IgG導(dǎo)致的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用，但是EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是多個通路或配體介導(dǎo)激活的獨(dú)立或共同作用。

3 PKC可能是橋粒黏附的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

PKC是一類脂質(zhì)敏感的絲氨酸/羧酸蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)增殖、分化、遷移、黏附和凋亡等多種功能。通過抑制或激活PKC，可以改變細(xì)胞間黏附，PKC的活化導(dǎo)致細(xì)胞黏附減弱，而抑制PKC則導(dǎo)致黏附增加[21]。一項(xiàng)研究表明，PV-IgG誘導(dǎo)的PKC活化導(dǎo)致其與角蛋白中間絲(keratin intermediate filaments, KIFs)解離，并導(dǎo)致橋粒斑蛋白(desmoplakin, DP)磷酸化，從而導(dǎo)致橋粒不穩(wěn)定[22]。

PKC可以被PV-IgG激活，PKC的活化是PV-IgG導(dǎo)致棘層松解的早期反應(yīng)[23]。PKC亞型可以介導(dǎo)PV-IgG誘導(dǎo)的KC上β連環(huán)蛋白(β-catenin)的磷酸化，而連環(huán)蛋白磷酸化的改變與KC內(nèi)聚的改變有關(guān)[24]。內(nèi)收蛋白(adducin)磷酸化是由PKC直接或間接介導(dǎo)的，而內(nèi)收蛋白可以調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏附[25]。

PV-IgG誘導(dǎo)的Dsg3耗竭、角蛋白收縮以及棘層松解可以被PKC抑制劑所阻斷[26]。PKC抑制劑可能是通過超黏附機(jī)制，形成更強(qiáng)的細(xì)胞間黏附從而保護(hù)KC免受PV自身抗體的影響，或者是通過調(diào)節(jié)Dsg3膜的穩(wěn)定性和Dsg3與細(xì)胞膜的結(jié)合概率從而穩(wěn)定橋粒結(jié)構(gòu)[27]。這些實(shí)驗(yàn)表明PKC在天皰瘡棘層松解發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但PKC具有廣泛的細(xì)胞活性，PKC抑制劑的應(yīng)用可能引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此充分理解PKC在棘層松解中的作用以及互補(bǔ)功能顯得十分重要。

4 RhoA與PV氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在PV的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，RhoA編碼小分子鳥苷三磷酸酶，作為分子開關(guān)調(diào)控細(xì)胞的各種進(jìn)程，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和凋亡，在上皮細(xì)胞連接中起重要作用。研究顯示，RhoA的激活可以逆轉(zhuǎn)PV自身抗體誘導(dǎo)的KC細(xì)胞黏附喪失，以及抑制水皰生成[28]。RhoA在維持橋粒穩(wěn)定中有重要作用，且RhoA的活性依賴于p38MAPK。抑制p38MAPK阻止了PV-IgG誘導(dǎo)的RhoA的活化，這說明p38MAPK信號通路位于RhoA的上游[28]。RhoA活化可能是作為治療天皰瘡的一個新靶點(diǎn)。

5 環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路限制p38MAPK的激活和Dsg3的損耗

天皰瘡小鼠模型中，β受體激動劑Iso提高小鼠內(nèi)cAMP水平后可以阻斷PV-IgG誘導(dǎo)的水皰形成；體外天皰瘡細(xì)胞模型研究顯示，PV-IgG共孵育的HaCaT細(xì)胞中檢測到cAMP水平的增加，增加cAMP可以預(yù)防PV-IgG誘導(dǎo)的Dsg3內(nèi)吞增加和棘層松解[23]。cAMP信號通路可能是通過干擾PV-IgG誘導(dǎo)的p38MAPK激活從而預(yù)防細(xì)胞黏連消失，這可能是PV中的一種補(bǔ)救途徑。

6 核因子-κB

核因子-κB(NF-κB)通路在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在NF-κB自身基因啟動子區(qū)94個插入/缺失位點(diǎn)(RS28362491)的多態(tài)性上，PV患者與對照組之間存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異[29]。多種炎癥因子和趨化因子的增加可能會使天皰瘡易感性增加。最近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示柚皮素抑制PV血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，下調(diào)Dsg1、Dsg3和E-鈣粘素(E-cadherin)，并且抑制NOD2介導(dǎo)的NF-κB通路，保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受凋亡和氧化應(yīng)激損傷[30]。

7 總結(jié)與展望

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對天皰瘡KC間黏附的改變具有重要作用，自身抗體結(jié)合抗原后下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控不同，可能導(dǎo)致天皰瘡不同的臨床表型。雖然大量研究表明了信號通路在PV發(fā)病機(jī)制中的重要性，但目前的證據(jù)尚不足以充分了解不同信號通路在PV棘層松解及水皰形成發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和貢獻(xiàn)，需要進(jìn)一步的研究來闡明這些信號通路之間的相互作用及上下游之間的級聯(lián)反應(yīng)等。深入了解PV發(fā)病信號通路，可以為全面闡明PV發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。另一方面，尋找抑制這些信號分子和通路的靶向藥物，減少使用糖皮質(zhì)激素，對提高天皰瘡患者的生存生活質(zhì)量有重要意義。