球形孢子絲菌伊曲康唑耐藥株在大蠟螟模型中的毒力和耐藥性評(píng)價(jià)

張靜， 何泰龍， 吳曉雁， 黃曉雯， 黃懷球

(1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120;2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630;3.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院皮膚科，廣東 珠海 519000;4.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510515)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由孢子絲菌復(fù)合體(Sporothrixschenckiicomplex)引起的皮膚、皮下組織及周圍淋巴系統(tǒng)的慢性感染，在南美洲及我國東北地區(qū)高發(fā)[1]。孢子絲菌復(fù)合體包括申克孢子絲菌(Sporothrixshenckiisensustricto)、巴西孢子絲菌(Sporothrixbrasiliensis)、球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa)、墨西哥孢子絲菌(Sporothrixmexicana)和盧艾里孢子絲菌(Sporothrixluriei)。我國孢子絲菌病的致病菌種為球形孢子絲菌[2]。孢子絲菌病主要表現(xiàn)為皮膚結(jié)節(jié)、斑塊、丘疹等增生性皮疹，免疫力低下患者則可能播散至全身引起系統(tǒng)損害進(jìn)而危及生命[1]。孢子絲菌病的首選治療藥物是伊曲康唑，但近年來有伊曲康唑耐藥的報(bào)道[3-4]。動(dòng)物模型對研究孢子絲菌病發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物效果至關(guān)重要。小鼠、大鼠是研究孢子絲菌病的經(jīng)典動(dòng)物模型，但其成本高、實(shí)驗(yàn)周期長。近年來，無脊椎動(dòng)物用于病原菌感染模型研究的報(bào)道越來越多[5-6]。

大蠟螟(GalleriamellonellaL.)屬于鱗翅目螟蛾科蠟螟亞科蠟螟屬昆蟲，其幼蟲固有免疫特點(diǎn)與哺乳動(dòng)物相似，且具有蛋白質(zhì)豐富、生長周期短、便于繁殖等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于病原菌感染模型進(jìn)行致病機(jī)制和藥物評(píng)價(jià)的研究[7-8]。目前已成功建立申克孢子絲菌和巴西孢子絲菌大蠟螟感染模型[9]，而球形孢子絲菌大蠟螟感染模型尚未建立。

本課題組前期在1例伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者皮損中分離出球形孢子絲菌，其體外藥敏顯示對伊曲康唑耐藥[10]。因此，本研究建立此球形孢子絲菌大蠟螟感染模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)此菌株的毒力和在體內(nèi)對伊曲康唑的敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和昆蟲

S.globosaSUMS0381分離自1例伊曲康唑治療失敗的淋巴管型孢子絲菌病患者皮疹，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定為S.globosa，菌株保存于-80 ℃的15%甘油中。按照CLSIM38-A2方案對其進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)[11]，藥敏結(jié)果顯示伊曲康唑的MIC值為8 μg/mL。對照敏感株為S.globosaCBS120340，由荷蘭皇家科學(xué)院真菌生物多樣性研究中心贈(zèng)送。根據(jù)CLSI38-A2方案進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果顯示伊曲康唑的MIC值為1 μg/mL。大蠟螟幼蟲采購于天津惠裕德生物科技有限公司，體重為200～240 mg，通體乳白無黑斑，5日齡，置于溫度為30～35 ℃、濕度為60%±10%的全黑暗環(huán)境培養(yǎng)。

1.2 試劑

馬鈴薯培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)干粉購自英國OXOID公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自大連美侖生物有限公司，純度為99%；伊曲康唑原藥購自上?；辽萍加邢薰?，純度大于98%。

1.3 菌懸液制備

將菌株置于25 ℃溫箱中復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的真菌轉(zhuǎn)種至PDA培養(yǎng)基，于25 ℃室溫下培養(yǎng)1周。用無菌接種針挑取表面菌落，放置于含磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的無菌試管中，渦旋使菌落分散；再用無菌濾器過濾，去除長菌絲；使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整分生孢子濃度。

1.4 模型建立

參考Clavijo-giraldo等[9]研究，用微量注射器將10 μL濃度為1×105/mL的S.globosa菌懸液經(jīng)幼蟲左下腹后足注射入大蠟螟體內(nèi)，將大蠟螟放入37 ℃溫箱觀察12天，記錄大蠟螟體表顏色變化、刺激反饋及存活情況，當(dāng)大蠟螟對觸摸刺激持續(xù)無反應(yīng)時(shí)認(rèn)為大蠟螟已死亡。設(shè)置空白對照組和注射10 μL PBS的陰性對照組。感染后48小時(shí)每組取2只幼蟲進(jìn)行組織病理檢查。

1.5 毒力檢測

將大蠟螟幼蟲分為8組，每組10只，將S.globosaSUMS0381和S.globosaCBS120340的菌懸液濃度分別調(diào)整至1×104/mL、1×105/mL和1×106/mL(對應(yīng)注射真菌數(shù)量分別為1×102cells/larva、1×103cells/larva和1×104cells/larva)，根據(jù)上述方法建立感染模型，并設(shè)置1個(gè)空白對照組和1個(gè)PBS對照組，觀察12天，記錄大蠟螟體表顏色變化、刺激反饋及存活情況。

1.6 藥物敏感性檢測

根據(jù)既往文獻(xiàn)[12]，將伊曲康唑溶解在1%的DMSO中，根據(jù)大蠟螟體重調(diào)整伊曲康唑濃度。將大蠟螟分為9組，每組15只，分別為空白組、空白注射20 mg/kg伊曲康唑組、空白注射40 mg/kg伊曲康唑組、S.globosaSUMS0381感染組、S.globosaSUMS0381感染后注射20 mg/kg伊曲康唑組、S.globosaSUMS0381感染后注射40 mg/kg伊曲康唑組、S.globosaCBS120340感染組、S.globosaCBS120340感染后注射20 mg/kg伊曲康唑組和S.globosaCBS120340感染后注射40 mg/kg伊曲康唑組。分別將S.globosaSUMS0381和S.globosaCBS120340菌懸液濃度調(diào)整為1×106/mL(1×104cells/larva)，根據(jù)上述模型建立方法建立大蠟螟幼蟲感染模型。注射菌液1 h后，根據(jù)分組向大蠟螟幼蟲體內(nèi)分別注射濃度為20 mg/kg和40 mg/kg的伊曲康唑溶液。觀察12天內(nèi)大蠟螟的存活情況，并在注射藥液48 h后每組取5只幼蟲切片勻漿后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0處理。生存曲線比較使用log-rank分析，死亡改善率比較使用卡方檢驗(yàn)，菌落下降率比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S. globosa感染大蠟螟模型

如圖1所示，接種S.globosa菌懸液前，大蠟螟幼蟲通體呈淺黃色，無色斑，行動(dòng)活躍，對外界刺激反應(yīng)靈敏。接種S.globosaSUMS0381菌懸液后第1天，所有大蠟螟幼蟲的接種部位及周圍出現(xiàn)黑斑并逐漸擴(kuò)大， 4天內(nèi)所有被感染的大蠟螟幼蟲全身呈黑色，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，平均死亡時(shí)間為4.4天。接種S.globosaCBS120340菌懸液的大蠟螟的外觀表現(xiàn)及存活情況和接種S.globosaSUMS0381的大蠟螟一致。在觀察周期內(nèi)，空白對照組和PBS組大蠟螟外觀無明顯變化，無死亡。接種S.globosaSUMS0381、S.globosaCBS120340菌懸液96 h的大蠟螟消化道內(nèi)可見真菌細(xì)胞成團(tuán)狀散在分布，消化道管腔結(jié)構(gòu)遭到破壞，證實(shí)S.globosa大蠟螟感染模型建立成功。

2.2 S. globosa在大蠟螟模型中的毒力

空白對照組和PBS組大蠟螟幼蟲均無死亡，在1×102cells/larva組，S.globosaSUMS0381和S.globosaCBS120340組雖有幼蟲死亡，但其生存曲線與空白對照組比較無明顯差異(均2=1.00，P=0.320)，兩組生存曲線比較無明顯差異(2=0.00，P=0.970)。在1×103cells/larva組，觀察終點(diǎn)12天時(shí)，S.globosaSUMS0381和S.globosaCBS120340的致死率均為50%，兩者之間的生存曲線無明顯差異(2=0.00，P=0.980)，但兩者與空白對照組的生存曲線差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均2=5.42，P=0.020)。在1×104cells/larva組，接種S.globosaSUMS0381后第3天大蠟螟的死亡率為100%， 接種S.globosaCBS120340第3天死亡率為100%，兩者之間的生存曲線無明顯差異(2=2.37，P=0.124)，而與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2值分別為17.70、17.32，P值均<0.001)。詳見圖2。

2.3 S. globosa對伊曲康唑的體內(nèi)敏感性

在空白組，注射20 mg/kg和40 mg/kg的伊曲康唑未影響大蠟螟的生存時(shí)間及活力。在感染組，注射20 mg/kg的伊曲康唑后，感染S.globosaSUMS0381和感染S.globosaCBS120340的大蠟螟的生存率分別提高20%和27%，兩者之間無明顯差異(2=0.19，P=1.000)，但感染S.globosaCBS120340的大蠟螟的菌落計(jì)數(shù)較之感染S.globosaSUMS0381下降更為明顯(12.41±1.29比22.93±1.23，t=-18.66，P<0.001)。注射40 mg/kg的伊曲康唑后，感染S.globosaSUMS0381和感染S.globosaCBS120340的大蠟螟的生存率分別提高40%和60%，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1.20，P=0.466)；與感染S.globosaSUMS0381的大蠟螟相比，感染S.globosaCBS120340大蠟螟的菌落計(jì)數(shù)降低更為明顯(22.32±2.55比43.74±2.59，t=-18.64，P<0.001)。詳見圖3。

圖1 大蠟螟幼蟲S. globosa感染模型及組織病理表現(xiàn)(黑色箭頭：真菌細(xì)胞團(tuán))

圖2 感染S. globosa的大蠟螟幼蟲生存曲線圖

圖3 伊曲康唑治療后S. globosa感染大蠟螟幼蟲的生存改善和載菌量變化

3 討論

大蠟螟幼蟲成本低廉，繁殖力強(qiáng)，生長周期短，無自殘性，可以在室內(nèi)20～30 ℃的溫度下高密度飼養(yǎng)；體積相對較大，有許多與人類基因同源物編碼產(chǎn)物且與哺乳動(dòng)物的天然免疫系統(tǒng)有許多相似之處，不受倫理限制。因此，大蠟螟是病原微生物的重要實(shí)驗(yàn)昆蟲模型工具[13]。

大蠟螟幼蟲的免疫應(yīng)答包括黑化、調(diào)理素和抗菌肽的產(chǎn)生[14]。大蠟螟幼蟲可以對真菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15]。既往研究表明大蠟螟幼蟲檢測白念珠菌毒力的結(jié)果與Balb/C 小鼠檢測此突變體毒力的結(jié)果一致[16]；大蠟螟幼蟲模型也已被證實(shí)適用于煙曲霉和雙相型真菌lutzii副球孢子菌、莢膜組織胞漿菌和申克孢子絲菌的毒力研究[17]。在大蠟螟感染模型中，通常用于評(píng)估真菌毒力的指標(biāo)是在觀察終點(diǎn)的幼蟲死亡數(shù)[18]。本研究中，大蠟螟幼蟲感染S.globosa后外觀出現(xiàn)黑化，部分幼蟲即使感染了低濃度(1×102cells/larva)S.globosa，其存活天數(shù)和未感染的一致，說明大蠟螟幼蟲產(chǎn)生了抗S.globosa免疫應(yīng)答，可以抵抗低濃度S.globosa感染。在觀察終點(diǎn)，S.globosaSUMS0381和S.globosaCBS120340在大蠟螟幼蟲上的生存曲線均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明S.globosa伊曲康唑耐藥株和敏感株的毒力無差異。病原菌是否耐藥和其毒力無明顯相關(guān)性，與菌株經(jīng)歷的篩選環(huán)境相關(guān)[19]。大蠟螟的黑化是大蠟螟免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答的標(biāo)志。本研究中，未觀察到不同濃度菌懸液感染的大蠟螟黑化程度有明顯差別，目前尚無研究證實(shí)大蠟螟的黑化和真菌毒力、載菌量有直接相關(guān)性。進(jìn)一步的研究將對大蠟螟黑化程度進(jìn)行評(píng)分，觀察大蠟螟黑化和真菌毒力以及真菌載量的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，大蠟螟幼蟲篩選抗菌藥物的功效與哺乳動(dòng)物一致，已用于多種抗真菌藥物敏感性的研究。Mylonakis等[20]用大蠟螟幼蟲建立新型隱球菌感染模型，評(píng)估兩性霉素B、氟胞嘧啶和氟康唑的抗新生隱球菌活性。Staniszewska等[21]使用大蠟螟幼蟲模型證實(shí)了新的四唑衍生物明顯提高了接種白念珠菌的幼蟲存活率和存活時(shí)間。Passos等[12]證實(shí)了脂質(zhì)納米顆粒包裹的伊曲康唑可以延長感染申克孢子絲菌的大蠟螟幼蟲的生存時(shí)間。本研究中，為了證實(shí)S.globosa耐藥株對伊曲康唑的敏感性，首先分別使用致死量的S.globosa耐藥株菌懸液和S.globosa敏感株菌懸液建立大蠟螟感染模型，注射20 mg/kg的伊曲康唑后，感染S.globosa耐藥株和感染S.globosa敏感株的大蠟螟的生存率分別提高20%和27%，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但感染S.globosa敏感株的大蠟螟的菌落計(jì)數(shù)下降更為明顯;分別向感染S.globosa耐藥株和S.globosa敏感株的大蠟螟體內(nèi)注射40 mg/kg的伊曲康唑后，感染S.globosa敏感株的大蠟螟的存活率高于感染S.globosa耐藥株的大蠟螟。20 mg/kg和40 mg/kg的伊曲康唑不影響未感染S.globosa的大蠟螟的存活，且S.globosa耐藥株和敏感株的毒力相同。綜合以上結(jié)果，推測在大蠟螟體內(nèi)，S.globosa耐藥株對伊曲康唑的敏感性較S.globosa敏感株低，與體外藥敏結(jié)果一致，提示大蠟螟幼蟲可以作為檢測S.globosa對伊曲康唑敏感性的體內(nèi)模型。大蠟螟幼蟲有與哺乳動(dòng)物相似的肝臟系統(tǒng)[22]，但伊曲康唑在大蠟螟幼蟲體內(nèi)的代謝途徑及如何發(fā)揮抗真菌活性有待進(jìn)一步研究。由于體內(nèi)研究的樣本量限制，本研究僅設(shè)置兩個(gè)藥物濃度組，未能進(jìn)一步明確S.globosa耐藥株在大蠟螟體內(nèi)對伊曲康唑的耐藥值。

綜上所述，在大蠟螟模型中，球形孢子絲菌伊曲康唑耐藥株的毒力和敏感株無差異，耐藥株對伊曲康唑的敏感性低于敏感株。