桔梗組織培養(yǎng)存在的問題及對策

馮淑月 黃玥明 張偉 王士杰

[摘 要] 本文對桔梗組織培養(yǎng)技術(shù)研究現(xiàn)狀及存在的關(guān)鍵性技術(shù)問題展開綜述，針對褐化因素、污染、玻璃化等影響組培效果的主要問題給出相應(yīng)解決措施，以期為桔梗組織培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 桔梗;組織培養(yǎng);褐變;污染

[中圖分類號] S567.239 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1674-7909（2020）21-94-2

桔梗（Platycodon grandiflorum）又名六角荷、鈴鐺花等，其根可入藥，為桔梗科多年生草本植物，是我國常用的重要中藥材，主產(chǎn)于我國東北、華北、華東、華中等地區(qū)，在世界各個地區(qū)均廣泛種植[1]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)指的是基于植物細(xì)胞全能性進行植物培育研究的一種技術(shù)[2]。目前，桔梗組織培養(yǎng)中存在諸多因素影響桔梗愈傷組培誘導(dǎo)和培養(yǎng)，且存在易褐化、玻璃化等問題，同時污染問題是影響桔梗組培效果的主要因素，亟待優(yōu)化上述問題。

1 桔梗組織培養(yǎng)外植體選擇及過程

1.1 桔梗組織培養(yǎng)外植體的選擇

桔梗的外植體選擇對后續(xù)試驗的有序進行有重要影響。桔梗外植體不同生理部位和生理狀態(tài)的不同，誘導(dǎo)效果和誘導(dǎo)出愈傷組織的誘導(dǎo)率也不同。采用桔梗葉片、莖段和根作為外植體，后續(xù)培養(yǎng)過程中均具有誘導(dǎo)出愈傷組織且發(fā)育成苗的能力。嚴(yán)一字等采用無菌苗的葉片、莖段和根段作為試驗材料，培養(yǎng)時均能誘導(dǎo)出愈傷組織，還發(fā)現(xiàn)不同外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比不同[3]。誘導(dǎo)階段選用葉、莖段和上胚軸作為外植體比較發(fā)現(xiàn)，上胚軸作為外植體可以縮短誘導(dǎo)時間，且可以簡化培養(yǎng)基。

1.2 桔梗組織培養(yǎng)過程

1.2.1 初代培養(yǎng)。目前，植物組織培養(yǎng)中最常見的培養(yǎng)基有MS、B5、White、N6、WPM和Anderson等種類。研究表明，以葉片作為外植體時選用N6培養(yǎng)基可以直接誘導(dǎo)出苗，效果最好，莖段為外植體時選用MS培養(yǎng)基效果最好。曲生嬌在誘導(dǎo)叢生芽階段以帶葉節(jié)莖段、葉片作為外植體，利用MS基本培養(yǎng)基并添加0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[4]。王桂梅等以桔梗莖段作為外植體，附加不同濃度的6-BA和NAA，得出最佳誘導(dǎo)桔梗外愈傷組織的配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L[5]。較高濃度的6-BA有利于愈傷組織的形成，但濃度過高會誘導(dǎo)腋芽形成簇狀分生組織，影響小苗的形成速度。

1.2.2 繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基與初代誘導(dǎo)培養(yǎng)及類型基本一致，但目的不同。秦梅等在增值培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)6-BA濃度過高或過低均會抑制側(cè)芽的萌發(fā)，影響繼代材料的擴大[6]。張燕等在桔梗叢芽增值試驗時，使NAA濃度相同，隨著6-BA濃度的增加，小苗的增值倍數(shù)也增加，說明6-BA對桔梗繼代誘導(dǎo)起促進作用[7]。繼代培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)隨著NAA濃度增加，叢生芽的增值倍數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

1.2.3 生根培養(yǎng)。桔梗的組培苗不添加外源激素均能生根，但根和苗的長勢均較弱。在桔梗生根培養(yǎng)時，隨著NAA濃度的升高生根數(shù)和生根率均會升高，但NAA濃度過高時，生根時間會延長，生根數(shù)、生根率均會降低。

2 桔梗組織培養(yǎng)中存在的問題

2.1 褐變現(xiàn)象

褐變又稱“褐化”，是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸褐變，培養(yǎng)材料隨之褐變甚至死亡的現(xiàn)象。桔梗組織培養(yǎng)引起褐化的主要機理是酶促反應(yīng)[8]，造成褐變的原因有很多，主要包括植物的種類和基因型、外植體的類型和生理狀態(tài)、外植體的大小和采樣時間、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分等。

2.2 污染現(xiàn)象

污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中，由于真菌、細(xì)菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)容器中滋生大量的菌斑，導(dǎo)致培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)育的現(xiàn)象[9]。在桔梗的組織培養(yǎng)過程中，污染常有發(fā)生，造成污染的原因有很多。例如，器具消毒不徹底，外植體滅菌不徹底，接種操作不當(dāng)，接種環(huán)境不干凈，超凈工作臺區(qū)域被污染，外植體材料內(nèi)部消毒不徹底等均會引發(fā)污染，以上因素均是組織培養(yǎng)過程中較難控制的問題。

2.3 玻璃化現(xiàn)象

玻璃化是指在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)材料呈半透明狀態(tài)，結(jié)構(gòu)組織發(fā)育成畸形的現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象一般出現(xiàn)在繼代培養(yǎng)過程中。細(xì)胞分裂素濃度過高，細(xì)胞分裂素與生產(chǎn)素相對含量高，培養(yǎng)基中離子種類比例不適、瓊脂和蔗糖濃度過低，培養(yǎng)條件不適宜，如不良培養(yǎng)環(huán)境、溫度過高、光照時間不足和通氣不良等因素均會引起玻璃化現(xiàn)象。

3 解決桔梗組織培養(yǎng)問題的有效措施

3.1 褐變防治措施

首先，桔梗組織培養(yǎng)過程中，選擇外植體時，生長季節(jié)植物體內(nèi)的酚類化合物較多，所以盡量選擇在早春或者晚春取材，一般選擇幼齡植株嫩莖作為外植體。外植體切口越大越容易發(fā)生褐化，外植體選材宜大不宜小，外植體切口宜小不宜大。其次，培養(yǎng)材料預(yù)處理時，要采用流水沖洗，在5 ℃左右處理12～24 h，消毒后接種在只含有蔗糖的培養(yǎng)基上5～7 d，使外植體中的酚類物質(zhì)部分滲透到培養(yǎng)基中。取出外植體，用科學(xué)的方法清洗干凈，再接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，可在一定程度上避免外植體褐化。其次，培養(yǎng)基應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臒o機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平與組合以及添加一些抗褐變劑，可減輕褐變的發(fā)生。添加抑制劑、吸附劑、活性炭、抗壞血酸可有效減輕組織培養(yǎng)過程中的酶促褐化現(xiàn)象。加入抗壞血酸的培養(yǎng)基發(fā)生褐變的概率小于不加的培養(yǎng)基。檸檬酸等也能夠有效避免或減輕褐變現(xiàn)象。培養(yǎng)初期應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，采用低溫（15～20 ℃）、黑暗、弱光環(huán)境，可有效防止高光和高溫引起褐化。對容易發(fā)生褐變的材料可間隔12～24 h再轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，這樣連續(xù)處理7～10 d后，褐變現(xiàn)象會得到一定程度的控制。

3.2 污染防治措施

首先，進行組培室的消毒滅菌。保證組培接種室無菌、干凈、整潔，能夠有效防止污染。每周對組培室進行一次大掃除和徹底的消毒滅菌;接種室和培養(yǎng)室要求密閉、干燥、保持與外界環(huán)境相對隔絕的狀態(tài)，減少與外界的空氣對流及微生物與塵埃的浸入，嚴(yán)格控制光照、溫度、濕度、空氣等各種生態(tài)因子。其次，加強培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基的消毒滅菌處理。培養(yǎng)瓶、試管等容器和封口用的蓋子、耐高溫的塑料膜等物品在用前均要經(jīng)過徹底清洗、晾干。配制好的培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即高壓蒸汽滅菌，放置兩三天，等到培養(yǎng)基表面和內(nèi)部無雜菌污染的情況下可認(rèn)為滅菌徹底，進行接種工作。再次，注意無菌操作。接種工作人員應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作要求，規(guī)范熟練地進行每一步操作，可減少操作不當(dāng)引起的污染。最后，清除污染傳播源。組織培養(yǎng)過程中污染是不可避免的，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)污染物，應(yīng)及時處理污染培養(yǎng)瓶，把污染物從培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移出去，再對污染物進行高壓滅菌消毒，清洗干凈待用[10]。

3.3 玻璃化防治措施

選擇外植體時，優(yōu)先考慮不易玻璃化的基因型及部位，選擇有助于降低玻璃化的頂芽作為外植體[11]。配制培養(yǎng)基時，添加外源生長調(diào)節(jié)劑如IAA、GA3、ABA，可減小玻璃化苗的出現(xiàn)。降低銨態(tài)氮濃度的同時提高硝態(tài)氮的含量，在大規(guī)模生產(chǎn)中成效顯著。適當(dāng)調(diào)整瓊脂濃度也可防止玻璃化的產(chǎn)生。添加有機物根皮苷、添加植物生長調(diào)節(jié)劑合成前體，如ACC，或添加適宜濃度的活性炭，均可有效抑制組培苗玻璃化的形成。改善培養(yǎng)條件，盡量采取光照培養(yǎng)，在適宜的光照時間內(nèi)適當(dāng)提高光照強度;確定桔梗材料的適宜培養(yǎng)溫度范圍;選擇適宜的濕度條件;適當(dāng)?shù)耐L(fēng)降低培養(yǎng)容器中的濕度等，均有利于防止組培苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。

4 結(jié)語

目前，藥用植物組織培養(yǎng)存在諸多不可調(diào)控因素，如培養(yǎng)條件、生長因子、污染原因、褐化現(xiàn)象和玻璃化因素等。目前，桔梗組織培養(yǎng)也僅限于試驗研究，不利于大規(guī)?；a(chǎn)。在科技迅速發(fā)展的今天，隨著植物生理學(xué)、生物化學(xué)、組織培養(yǎng)學(xué)、植物學(xué)等學(xué)科的不斷滲透及各方研究的不斷合作，將會逐步解決組織培養(yǎng)技術(shù)中的難題，避免不可控因素的出現(xiàn)，保證組培效果。

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基金項目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目“桔梗的組織培養(yǎng)及抗鹽堿性研究”（2019007）。

作者簡介：馮淑月（1995—），女，本科在讀，研究方向：中草藥栽培與鑒定。

通信作者：王士杰（1978—），男，博士，副教授，研究方向：中草藥栽培與加工。