鹽度對(duì)可口革囊星蟲(chóng)受精卵孵化、幼體存活和生長(zhǎng)的影響

林向陽(yáng)，張齊斌，李雷斌

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013；2.寧德市蕉城區(qū)漳灣鎮(zhèn)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 寧德 352100)

0 引言

可口革囊星蟲(chóng)(Phascolosoma esculenta)，隸屬于星蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)、革囊星蟲(chóng)綱、革囊星蟲(chóng)科，為我國(guó)特有種，也是我國(guó)星蟲(chóng)中產(chǎn)量較大的種類(lèi)之一[1-2]?？煽诟锬倚窍x(chóng)生活在河口灘涂區(qū)，其生活史分為兩個(gè)階段——浮游階段和底棲階段，這兩個(gè)階段都會(huì)受到鹽度變化的影響。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)星蟲(chóng)早期幼體發(fā)育研究主要集中在裸體方格星蟲(chóng)(Sipunculus nudusLinnaeus)和可口革囊星蟲(chóng)兩個(gè)種類(lèi)。例如：曾志南等[3]開(kāi)展了光裸方格星蟲(chóng)(現(xiàn)已訂名為裸體方格星蟲(chóng))初期海球幼體對(duì)溫度和鹽度的耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明光裸方格星蟲(chóng)初期海球幼體對(duì)低鹽度相對(duì)敏感，對(duì)高鹽度有較強(qiáng)的耐受力，而對(duì)溫度特別是低溫的耐受能力也較強(qiáng)；吳洪喜等[4]、陳慧等[5]先后研究了可口革囊星蟲(chóng)胚胎與幼體的早期發(fā)育過(guò)程[4-5]。迄今為止，有關(guān)鹽度對(duì)可口革囊星蟲(chóng)受精卵、幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究開(kāi)展了鹽度對(duì)可口革囊星蟲(chóng)孵化、幼體存活及生長(zhǎng)的影響，旨在探索可口革囊星蟲(chóng)從浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞钸^(guò)程中其對(duì)鹽度變化的適應(yīng)性，也為優(yōu)化可口革囊星蟲(chóng)人工苗種培育技術(shù)和合理規(guī)劃養(yǎng)殖水域提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 受精卵及幼蟲(chóng)來(lái)源

可口革囊星蟲(chóng)親體采集于寧德市蕉城區(qū)三都澳的自然海區(qū)。挑選健康、形態(tài)正常、體表無(wú)破損的約60kg(平均個(gè)體體重4.61g)親體，在福建省海水魚(yú)類(lèi)苗種繁育科研中試基地培育，經(jīng)人工催產(chǎn)后獲得受精卵。受精卵在孵化池孵化后，在解剖鏡下挑選發(fā)育正常的幼體，用于下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)海水為經(jīng)沉淀的蓄水池水，經(jīng)沙濾后使用。實(shí)驗(yàn)期間海水水溫為26～30.5 ℃、鹽度為25～26、pH值為7.6～8.5。

1.2 鹽度梯度的設(shè)置

不同實(shí)驗(yàn)的鹽度梯度設(shè)置不同：受精卵孵化實(shí)驗(yàn)設(shè)置8個(gè)鹽度組，分別為5、10、15、20、25～26、30、35、40；幼蟲(chóng)不投餌實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)鹽度組，分別為10、15、20、25～26、30、35；幼蟲(chóng)培育設(shè)置4個(gè)鹽度組，分別為15、20、25～26、30。都以鹽度25～26的自然海水組作為對(duì)照組，不同鹽度組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。較高鹽度的海水以砂濾海水添加鹽鹵配制而成，而低鹽度的海水以砂濾海水加一定比例蒸餾水配制而成。研究幼蟲(chóng)不投餌存活系數(shù)(survivalactivityindex,SAI)的實(shí)驗(yàn)海水需經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾并經(jīng)高溫消毒后方可使用。

1.3 不同鹽度對(duì)受精卵孵化的影響

用50mL的培養(yǎng)皿，各放入100粒發(fā)育至囊胚期的受精卵，靜水孵化，不同批次的受精卵重復(fù)進(jìn)行3次。在水溫28.5～30.3 ℃條件下，受精卵孵化45～50h后，計(jì)算孵化率。孵化率計(jì)算公式為：

孵化率(%)=[孵出海球幼蟲(chóng)數(shù)/受精卵數(shù)]×100%。

(1)

1.4 不同鹽度條件下幼蟲(chóng)不投餌存活系數(shù)的測(cè)定

在水產(chǎn)苗種培養(yǎng)中，通常以SAI為指標(biāo)衡量幼體的活力[6]。本次實(shí)驗(yàn)中，采用SAI來(lái)判斷可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)的活力。待海球幼蟲(chóng)完全孵化后，在解剖鏡下選擇活力正常的初孵海球幼體50只，放入裝有30 mL不同鹽度海水的小型培養(yǎng)皿中，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)靜水培養(yǎng)，不投餌。由于幼蟲(chóng)死亡后不易觀察，需要每天在解剖鏡下觀察存活數(shù)，待幼蟲(chóng)全部死亡后，對(duì)不同鹽度條件下仔魚(yú)的SAI值進(jìn)行方差分析，對(duì)方差分析檢驗(yàn)顯著的進(jìn)一步用最小顯著差數(shù)法(LSD法)進(jìn)行多重比較。SAI的計(jì)算公式為：

(2)

其中N為起始的幼蟲(chóng)數(shù)，k為幼蟲(chóng)全部死亡所需的天數(shù)，hi為第i天幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡數(shù)。

1.5 不同鹽度對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

實(shí)驗(yàn)采用3 L玻璃燒杯放入同批次的初孵海球幼蟲(chóng)，密度為0.5只/mL。用小型增氧泵微充氣孵化，水溫控制在28.2～30.6 ℃，一般每天換水量約為30%。培育期間，根據(jù)幼蟲(chóng)的胃腸情況適量投喂小球藻，以大部分幼蟲(chóng)胃腸飽滿為準(zhǔn)。隨著幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，后期海球幼蟲(chóng)具有運(yùn)動(dòng)和攝食功能的口前纖毛環(huán)和口后纖毛環(huán)擺動(dòng)頻率下降，蟲(chóng)體活動(dòng)范圍小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程觀察，可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)前期海球幼蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)間一般約為9 d，因此，本實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)定為9 d。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，各組每次取樣20只幼蟲(chóng)，測(cè)量開(kāi)始時(shí)、第5天及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的幼蟲(chóng)體長(zhǎng)(以運(yùn)動(dòng)時(shí)狀態(tài)的體長(zhǎng)為準(zhǔn))。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清點(diǎn)存活幼蟲(chóng)數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)不同鹽度海水中幼蟲(chóng)的成活率。存活率計(jì)算公式為：

存活率(%)=N2/(N0-N1)×100%，

(3)

其中N2為最終存活數(shù)，N0為起始尾數(shù)，N1為取樣標(biāo)本數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽度下受精卵的孵化率和胚胎發(fā)育比較

在水溫28.5～30.3 ℃條件下，先后測(cè)定3批受精卵在不同鹽度下的孵化率(見(jiàn)表1)。從孵化率看，在鹽度10～35范圍內(nèi)，可口革囊星蟲(chóng)受精卵均可孵化。其中：以鹽度20組和自然海水(25～26)組這兩組的孵化率較高，孵化率分別為86.2%、88.1%，但兩者之間無(wú)明顯差異(P>0.05)；其次為高鹽度30組，孵化率為71.2%，與鹽度20組和自然海水組之間差異顯著(P<0.05)；低鹽度15組孵化率下降為40.1%，與其他組之間存在明顯差異(P<0.05)；而高鹽度35組和低鹽度10組，孵化率分別降至26.0%和5.8%，與鹽度15、20、25～26、30組之間差異顯著(P<0.05)；而鹽度0組和40組，受精卵孵化率則為0。

表1 不同鹽度條件下可口革囊星蟲(chóng)受精卵的孵化率

就受精卵的胚胎發(fā)育狀況而言，在鹽度20、25～26和30條件下，受精卵發(fā)育正常，當(dāng)發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲(chóng)期時(shí)，擔(dān)輪幼蟲(chóng)個(gè)體游動(dòng)快速，且在48 h內(nèi)全部完成孵化，孵出的幼體活力旺盛。然而，鹽度15組和35組的受精卵發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲(chóng)期時(shí)，擔(dān)輪幼蟲(chóng)個(gè)體轉(zhuǎn)動(dòng)緩慢，僅部分幼蟲(chóng)完成孵化且幼蟲(chóng)發(fā)育延滯。值得注意的是，鹽度35組孵化出的海球幼蟲(chóng)的活力偏弱，而低鹽度15組則活力正常。鹽度10組受精卵的發(fā)育狀況與鹽度15組和35組相類(lèi)似，但受精卵的孵化率低，孵出的幼蟲(chóng)活力偏弱。鹽度5組和40組的受精卵孵化至擔(dān)輪幼蟲(chóng)期時(shí)，個(gè)體活力明顯較差并最終死亡(見(jiàn)表2)。

表2 鹽度對(duì)可口革囊星蟲(chóng)胚胎發(fā)育的影響

由此可見(jiàn)，鹽度15～30適宜于可口革囊星蟲(chóng)受精卵孵化，鹽度20～26為最適鹽度范圍，呈現(xiàn)出受精卵發(fā)育對(duì)低鹽度的適應(yīng)。

2.2 不同鹽度下可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)的不投餌存活系數(shù)

分別測(cè)定了6個(gè)不同鹽度條件下，3批次可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)的不投餌存活系數(shù)(SAI)，結(jié)果(見(jiàn)表3)表明：在鹽度10、15、20、25～26、30、35條件下，可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)的SAI依次分別為9.8、78.3、60.9、12.6、12.2、10.7。其中低鹽度15組的SAI最高，為78.3；其次是鹽度20組，為60.9，鹽度15組和20組之間差異顯著(P<0.05)；鹽度25～26組、30組、35組的SAI值分別為12.6、12.2和10.7，三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，但與鹽度15組、20組相比，均存在顯著差異(P<0.05)；鹽度10組和鹽度35組的SAI值分別為9.8和10.7，兩組間不存在明顯差異(P>0.05)。

表3 不同鹽度下可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)不投餌存活系數(shù)

比較了各鹽度組幼蟲(chóng)的存活狀態(tài)，結(jié)果(見(jiàn)表4)表明，鹽度15組、20組的幼蟲(chóng)存活時(shí)間最長(zhǎng)，為7 d，其余各組存活時(shí)間均低于7 d。其中：鹽度10組第1天幼體收縮成一團(tuán)，沉于底部，幾乎不游動(dòng)，口前纖毛環(huán)和口后纖毛環(huán)擺動(dòng)頻率偏低；第2天出現(xiàn)個(gè)別幼蟲(chóng)死亡；第3天少量幼蟲(chóng)死亡；第4天出現(xiàn)大量個(gè)體死亡；第6天全部死亡。鹽度15組，第1天幼蟲(chóng)游動(dòng)緩慢；第2天恢復(fù)正常；第3天大多數(shù)幼蟲(chóng)沉底且游動(dòng)緩慢；第4天出現(xiàn)個(gè)別幼蟲(chóng)死亡；第6天大多數(shù)幼蟲(chóng)出現(xiàn)死亡；第7天全部死亡。鹽度20組和鹽度15組較類(lèi)似，也是至第4天才出現(xiàn)個(gè)體死亡現(xiàn)象，與鹽度15組有所差異的是第1天幼蟲(chóng)活動(dòng)正常。自然海水組和鹽度30組的幼蟲(chóng)存活情況基本類(lèi)似，第1～2天活動(dòng)正常；第3天少量幼蟲(chóng)沉底且游動(dòng)緩慢；第4天出現(xiàn)少量幼蟲(chóng)死亡；第6天全部死亡。高鹽度35組的幼蟲(chóng)明顯不適應(yīng)高鹽度環(huán)境，前兩天表現(xiàn)出游動(dòng)緩慢；第3天大部分沉底；第4天開(kāi)始少量幼蟲(chóng)死亡，存活的幼蟲(chóng)也幾乎不動(dòng)，僅纖毛可以緩慢擺動(dòng)。

表4 不同鹽度下可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)不投餌存活情況

從幼蟲(chóng)的不投餌系數(shù)及幼蟲(chóng)的活動(dòng)狀況，可以發(fā)現(xiàn)適宜于幼蟲(chóng)生存的鹽度范圍為15～30，最適范圍為15～20，也呈現(xiàn)出對(duì)低鹽度的適應(yīng)性。

2.3 不同鹽度下幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)指標(biāo)比較

在水溫28.5～30.5 ℃的情況下，測(cè)定了各鹽度組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速度，具體如表5所示。

表5 不同鹽度條件下海球幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度的比較

表5表明，經(jīng)過(guò)9 d的培育，幼蟲(chóng)體長(zhǎng)從251.7 μm長(zhǎng)至542.9～568.5 μm，日生長(zhǎng)速度為60.3～63.2 μm /d。從初孵海球幼蟲(chóng)培育至第5天，鹽度15組、20組、25～26組和30組的體長(zhǎng)分別為(421.1±18.6)μm、(422.9±24.0)μm、(426.1±20.3)μm和(412.0±17.3)μm，生長(zhǎng)速度是自然鹽度組(25～26)最快，鹽度30組最慢，但這4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。培育至第9天時(shí)，4組體長(zhǎng)分別為(549.4±27.9)μm、(568.5±28.3)μm、(551.7±25.3)μm、(542.9±27.7)μm，鹽度20組生長(zhǎng)最快，鹽度30組最慢，其中鹽度20組與15組、25～26組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，而與鹽度30組之間差異顯著(P<0.05)。比較了幼蟲(chóng)的成活率，結(jié)果(見(jiàn)表6)表明，幼蟲(chóng)在鹽度15、20、25～26和30條件下培育9 d后，其成活率分別為63.4%、75.9%、72.8%和60.2%，以鹽度20時(shí)的成活率最高。

表6 不同海水鹽度條件下海球幼蟲(chóng)存活率

3 討論

3.1 鹽度對(duì)孵化率的影響

本研究結(jié)果顯示，可口革囊星蟲(chóng)的受精卵在較大的海水鹽度范圍(10～35)內(nèi)均可孵化，其中鹽度20～30較適宜受精卵的孵化，但最適的鹽度范圍為20～26。方文珊等[7]對(duì)裸體方格星蟲(chóng)的研究表明，方格星蟲(chóng)受精卵的最適、較適、適宜、臨界孵化鹽度分別是21.72～26.94、20.04～28.90、17.48～31.26、16.5～34.14。本研究結(jié)果與之相似，但與之不同的是，可口革囊星蟲(chóng)最低臨界孵化鹽度為10，低于裸體方格星蟲(chóng)的最低臨界孵化鹽度。這可能與可口革囊星蟲(chóng)生長(zhǎng)在河口區(qū)的海域?yàn)┩坑泻艽蟮年P(guān)系。河口區(qū)海域鹽度變化幅度較大，可口革囊星蟲(chóng)對(duì)低鹽環(huán)境具長(zhǎng)期適應(yīng)性。許多海水魚(yú)類(lèi)的受精卵能夠在較大的海水鹽度范圍內(nèi)正常孵化與發(fā)育，可能與受精卵發(fā)育至神經(jīng)胚時(shí)期后，與外界的物質(zhì)交換降低，以及卵黃栓關(guān)閉后的受精卵已經(jīng)建立起較為完善的鹽度控制系統(tǒng)有關(guān)[8-9]。

3.2 鹽度對(duì)孵化時(shí)間的影響

有關(guān)鹽度對(duì)孵化時(shí)間的影響，在魚(yú)類(lèi)上已有較多研究。在點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelus malabaricus)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevisGunther)的研究中，認(rèn)為不同鹽度對(duì)孵化時(shí)間的影響不顯著[10-12]。關(guān)于狀黃姑魚(yú)(Nibeamiichthioides)[13]、尖鰭鯉(Cyprinusacutidorsalis)[14]、七帶石斑魚(yú)(E.septemfasciatus)[15]的研究表明鹽度越高，仔魚(yú)孵化時(shí)間越短。而奧尼羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×O.aureus)[16]、大銀魚(yú)(Protosalanxhyalocranius)[17]的研究表明，孵化周期隨鹽度的增加而增加。徐永江等[18]在條石鯛(Oplegnathusfasciatus)研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度過(guò)高或過(guò)低，會(huì)引起受精卵孵化時(shí)間的延長(zhǎng)。可見(jiàn)，不同種類(lèi)受精卵的孵化時(shí)間與鹽度的關(guān)系有所不同。

本研究中，在鹽度20、25～26、30條件下,48h內(nèi)均能正常孵出海球幼蟲(chóng)；而在鹽度10、15、35時(shí)，受精卵孵化時(shí)間明顯比正常孵化的時(shí)間延后，超過(guò)48h，除鹽度15組孵出的幼蟲(chóng)游動(dòng)正常外，鹽度10組、35組的幼蟲(chóng)表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境不適應(yīng)，游動(dòng)偏弱。從孵化進(jìn)程也可看出鹽度20～30為可口革囊星蟲(chóng)受精卵較適宜的孵化鹽度。

3.3 鹽度對(duì)幼蟲(chóng)活力的影響

不投餌存活系數(shù)(SAI)通常用于判斷初孵幼體的活力。對(duì)大多數(shù)魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，在無(wú)投餌條件下，觀察仔魚(yú)耐受能力和存活天數(shù)，SAI值越高，代表仔魚(yú)的活力就越好[6]。在適宜鹽度下，不同種類(lèi)的SAI有一定的差異。如黃鰭東方鲀(Takifuguxanthopterus)[19]在鹽度5和15時(shí)，其SAI值達(dá)78.37和85.38，在鹽度10和20時(shí)也有70.1和70.63，而菊黃東方鲀(Fuguflavidus)[20]的SAI最高值為30.10；赤點(diǎn)石斑魚(yú)(E.akaara)[6]的SAI值明顯比斜帶石斑魚(yú)(E.coioides)[21]、云紋石斑魚(yú)(E.moara)[22]及七帶石斑魚(yú)(E.septemfasciatus)[23]要低；黃姑魚(yú)類(lèi)中的雙棘黃姑魚(yú)(N.diacanthus)[24]的SAI值最大為7.13，與大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[25]差異較大；鯛科魚(yú)類(lèi)的黃鯛(Dentextumifrons)[26]的SAI值較大，為47.53。

本研究中，在鹽度10～35范圍內(nèi)，可口革囊星蟲(chóng)幼蟲(chóng)在鹽度15、20時(shí)SAI值較高，分別為78.3、60.9，而在其他鹽度時(shí)則明顯較低，為9.86～12.6。表現(xiàn)出對(duì)低鹽度較高的忍受力。

3.4 鹽度對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響

本研究表明，在9d的培育期間，海球幼蟲(chóng)培育的生長(zhǎng)速度和成活率，鹽度20組均為最高，分別為63.2μm/d、75.9%；其次為自然海水(25～26)組，分別為61.3μm/d、72.8%；鹽度15組的幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度為61.0μm/d，與自然海水組相差不大，但成活率為63.4%，略低于自然海水組；高鹽度30組，幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速度最慢且平均成活率也最低。與9d生長(zhǎng)速度比較，幼蟲(chóng)的5d生長(zhǎng)速度是自然海水組最快，平均達(dá)85.2μm/d；其次為鹽度20組，達(dá)84.6μm/d；再次為鹽度15組，達(dá)84.2μm/d；最慢的是鹽度30組，平均達(dá)82.4μm/d?？梢?jiàn)，低鹽度組幼蟲(chóng)在前期生長(zhǎng)速度比正常鹽度組慢，但在培育后期，生長(zhǎng)速度卻比自然鹽度組快。

這種現(xiàn)象與王麗華等[27]的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。在其實(shí)驗(yàn)中褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[27]幼魚(yú)在低鹽(鹽度5)脅迫10d后，特定生長(zhǎng)率為0.79%·d-1，小于鹽度19組的2.20%·d-1，但經(jīng)過(guò)10d的培育，鹽度5組的特定生長(zhǎng)率增加為1.96%·d-1，大于鹽度19組的1.52%·d-1，幼魚(yú)引起的生長(zhǎng)阻滯在30d內(nèi)得到補(bǔ)償。因而認(rèn)為補(bǔ)償生長(zhǎng)的機(jī)制與營(yíng)養(yǎng)脅迫和其他環(huán)境因子脅迫后的補(bǔ)償生長(zhǎng)機(jī)制類(lèi)似，依靠恢復(fù)最佳條件后攝食量的提高而獲得，但在高鹽度脅迫下未觀察到褐斑牙鲆獲得補(bǔ)償生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，可口革囊星蟲(chóng)更適合在稍低鹽度的海水中生長(zhǎng)，可能與可口革囊星蟲(chóng)成體長(zhǎng)期生活在河口區(qū)的灘涂中，從幼蟲(chóng)階段就對(duì)低鹽環(huán)境具備一定的適應(yīng)能力，有利于向低鹽灘涂穴棲生活過(guò)渡有關(guān)。