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    解脂亞羅酵母Y-2對葡萄采后病害及赭曲霉毒素A的控制作用

    2020-09-01 01:57:48張曉云顧香玉趙利娜鄭香峰楊紅娟張紅印
    中國食品學(xué)報 2020年8期
    關(guān)鍵詞:傷口處酵母葡萄

    張曉云 顧香玉 趙利娜 鄭香峰 楊紅娟 李 軍 張紅印*

    (1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212003)

    葡萄皮薄多汁, 在貯藏和運(yùn)輸過程中極易受到病原菌的侵染而引起腐爛變質(zhì), 降低其食用品質(zhì)和商業(yè)價值,并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。純綠青霉(Penicillium verrucosum)[1-2]、 赭曲霉(Aspergillus ochraceus)[3]、炭黑曲霉(A. carbonarius)[4-6]以及黑曲霉(A. niger)[5-6]等致病菌不僅能引起葡萄采后腐爛, 還會產(chǎn)生有毒的次級代謝產(chǎn)物——赭曲霉毒素A(OTA)。OTA 主要以其腎毒性而聞名,此外還具有肝毒性、致癌性、致畸性、免疫以及遺傳毒性等[7]。 葡萄被產(chǎn)OTA 的病原菌侵染后,不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 還會對人類健康造成極大的危害[8-9],必須采取有效的措施控制葡萄采后病害及OTA 污染??刂芆TA 產(chǎn)生菌的生長是控制葡萄及其制品OTA 污染的最有效措施[10-11]。 利用化學(xué)殺菌劑可有效控制OTA 產(chǎn)生菌的生長, 從而控制OTA 的污染。 然而,化學(xué)殺菌劑長期、大量的使用會使致病菌產(chǎn)生耐藥性,造成環(huán)境污染,其殘留和積累還會對人類健康造成危害[8,12]。 利用拮抗酵母進(jìn)行生物防治的方法逐漸引起國內(nèi)外研究人員的重視并呈現(xiàn)良好的應(yīng)用前景。

    微皺籃狀菌(Talaromyces rugulosus)O1 是本實(shí)驗(yàn)室從葡萄上分離、篩選到的能夠產(chǎn)生OTA 的致病菌[13],而解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)Y-2 是從葡萄上分離、 篩選到的1 株能夠體外降解OTA 的酵母菌株[14]。 本文以該酵母菌株為研究對象, 考察其對不同品種葡萄由微皺籃狀菌O1引起的采后病害以及OTA 積累的控制效果,以期為拮抗酵母在葡萄采后病害和OTA 控制中的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要設(shè)備與儀器

    全自動高壓蒸汽滅菌器,美國zealway 醫(yī)療器械有限公司;Eppendorf 5810R 高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf 公司;LRH-250 生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司; 安捷倫1260 高效液相色譜儀,Agilent Technologies 公司。

    1.2 培養(yǎng)基

    1)NYDA 培養(yǎng)基 8 g 牛肉浸膏,5 g 酵母浸膏,20 g 瓊脂粉以及10 g 葡萄糖,溶解后用蒸餾水定容1 000 mL,121°C 滅菌20 min。

    2)PM 培養(yǎng)基 2 g 麥芽糖,10 g 蔗糖,5 g 酵母浸膏,5 g 蛋白胨, 用蒸餾水定容1 000 mL,121℃滅菌20 min。

    3)PDA 培養(yǎng)基 200 g 去皮土豆,將其切塊、煮沸20 min, 過濾并添加20 g 葡萄糖,20 g 瓊脂粉,用蒸餾水定容1 000 mL,115°C 滅菌20 min。

    1.3 微生物培養(yǎng)

    挑取2~3 環(huán)NYDA 斜面上的解脂亞羅酵母Y-2 于含有50 mL PM 培養(yǎng)基的三角瓶中,在28℃、 180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)36 h,然后在4 ℃、7 500×g 條件下離心10 min,收集菌體,用無菌水洗滌,重復(fù)此操作2 次。以無菌水調(diào)至合適濃度待用。

    挑取PDA 斜面上的微皺籃狀菌O1 孢子,于PDA 斜面上劃線, 置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周,然后以無菌水洗下孢子, 調(diào)整孢子濃度為1×105孢子/mL。

    1.4 葡萄預(yù)處理

    采用商業(yè)成熟度良好且表面無破損、 質(zhì)地均勻、大小一致的葡萄,用自來水沖洗表面,然后用0.1%NaClO 溶液浸泡1 min, 自來水沖洗干凈,放入消毒塑料筐中于室溫晾干,備用。

    1.5 OTA 濃度的測定

    參考Yang 等[14]的方法,利用高效液相色譜(HPLC)測定OTA 濃度。 具體條件:Zorbax SBC18 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-1%乙酸(體積比60 ∶40),流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫30 °C,檢測波長和激發(fā)波長均為333 nm,發(fā)射波長460 nm。

    1.6 解脂亞羅酵母Y-2 處理對葡萄采后病害的控制作用

    參考Li 等[15]的方法,用打孔器在葡萄赤道處打孔3 mm(寬)×3 mm(深),每孔接種10 μL 解脂亞羅酵母Y-2 菌懸液。 2 h 后接種10 μL 微皺籃狀菌O1 孢子懸浮液(1×105孢子/mL)。 2 h 后用保鮮膜將塑料筐包裹起來,置于恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(25°C,RH 95%)貯藏,分別記錄第14 天葡萄的腐爛直徑。 每框包含36 個葡萄,每個試驗(yàn)3 個平行,整個試驗(yàn)重復(fù)兩次。以無菌水代替解脂亞羅酵母Y-2 菌懸液作為對照組。

    考察解脂亞羅酵母Y-2 對不同品種葡萄(夏黑、巨峰、紅提)采后病害的控制作用,操作方法同上。 酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL。

    考察不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對紅提葡萄采后病害的控制作用時, 酵母菌懸液的濃度分別為1×106,1×107,1×108,1×109細(xì)胞/mL。

    考察解脂亞羅酵母Y-2 處理對貯藏不同時間的紅提葡萄采后病害的控制作用, 酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL, 記錄腐爛直徑的時間分別為9,11,13,15,17 d。

    1.7 解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄中OTA 的控制作用

    操作同1.6 節(jié),14 d 時測定不同品種葡萄傷口處OTA 的積累量。 OTA 的提取方法:取腐爛直徑相似的葡萄(夏黑、巨峰、紅提),打漿,將漿液轉(zhuǎn)移至錐形瓶中, 加入一定體積的三氯甲烷, 置于25°C 搖床中緩慢振搖24 h,收集萃取液。 重復(fù)萃取2 次,合并萃取液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。蒸發(fā)結(jié)束后在避光條件下向近干的圓底燒瓶中快速加入1 mL 甲醇復(fù)溶,離心(12 000 × g,15 min)后的上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾,用于OTA 濃度測定。葡萄傷口處的OTA 積累量以ng/傷口計。

    考察解脂亞羅酵母Y-2 對不同品種葡萄(夏黑、巨峰、紅提)傷口處OTA 積累的控制作用時,操作方法同上,酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL。

    考察不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對紅提葡萄傷口處OTA 積累的控制作用時,酵母菌懸液的濃度分別為1×106,1×107,1×108,1×109細(xì)胞/mL。

    考察解脂亞羅酵母Y-2 處理對貯藏不同時間的紅提葡萄傷口處OTA 積累的控制作用,酵母菌懸液的濃度為1×108細(xì)胞/mL, 取樣測定OTA的時間分別為9,11,13,15,17 d。

    1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、方差同質(zhì)性檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05 時,數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄采后病害和OTA的控制作用

    由圖2 可知,微皺籃狀菌O1 在不同品種葡萄傷口處產(chǎn)生的OTA 各不相同, 紅提中含量最高,夏黑和巨峰中OTA 含量極低。 而經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理后, 葡萄傷口處OTA 含量均低于對照,尤其是紅提傷口處OTA 含量降低最為顯著,與對照相比降低了83.3%。由于微皺籃狀菌O1 在夏黑

    如圖1 所示,解脂亞羅酵母Y-2 對不同品種葡萄采后由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛均有顯著的控制作用,能顯著降低葡萄的腐爛直徑。與對照相比,經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的夏黑、巨峰和紅提葡萄, 第14 天的腐爛直徑分別降低了28.7%,19.7%和18.5%。和巨峰葡萄中產(chǎn)生的OTA 量太低,因此無法考察解脂亞羅酵母Y-2 對OTA 積累的控制效果。后續(xù)試驗(yàn)選用紅提葡萄作為研究對象。

    圖1 解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.1 Effect of Y. lipolytica Y-2 on the lesion diameter of grapes caused by T. rugulosus O1

    圖2 解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄傷口處OTA積累量的影響Fig.2 Effect of Y. lipolytica Y-2 on OTA accumulation in the wounds of grapes

    近十幾年來, 國內(nèi)外利用拮抗酵母控制農(nóng)產(chǎn)品由致病菌引起的采后病害及真菌毒素污染的研究取得一定的成果。Velmourougane 等[16]發(fā)現(xiàn),用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)處理田間咖啡,可以顯著降低由黑曲霉和赭曲霉引起的發(fā)病率及OTA 的產(chǎn)生。 Zhu 等[17]研究表明,假絲酵母(Candida zemplinina)M3、釀酒酵母M114、釀酒酵母C297、克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)M117 和Metschnikowia aff. fructicola M179 5 株酵母菌均能夠顯著抑制葡萄上炭黑曲霉和赭曲霉的生長及OTA 的產(chǎn)生。 本研究中,解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的采后病害均有顯著的控制效果,能顯著降低紅提葡萄傷口處OTA 的積累。OTA 在葡萄傷口處積累的減少,一方面是由于拮抗酵母抑制了產(chǎn)毒菌的生長[11,16-17],另一方面是該酵母對產(chǎn)生的OTA 的降解作用[14]。

    2.2 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對紅提葡萄采后病害和OTA 的控制作用

    如圖3 所示, 不同濃度的解脂亞羅酵母Y-2對紅提葡萄采后由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛均有控制作用,尤其是高濃度的拮抗酵母。與對照相比,1×107,1×108,1×109細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 處理均可顯著減小紅提葡萄的腐爛直徑,且葡萄腐爛直徑隨酵母濃度的增加而減小。 當(dāng)酵母濃度為1×108細(xì)胞/mL 時, 其腐爛直徑為19.5 mm,相比于對照(25.8 mm)降低了23.8%。

    如圖4 所示, 不同濃度的解脂亞羅酵母Y-2對紅提葡萄傷口處由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA積累均有顯著的控制效果。 對照組葡萄傷口處OTA 積累量為50 ng/傷口, 而經(jīng)1×108細(xì)胞/mL和1×109細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 處理的葡萄傷口處OTA 積累量分別為5.95 ng/傷口和3.53 ng/傷口,OTA 積累量顯著降低。 葡萄傷口處OTA 的積累量隨著解脂亞羅酵母Y-2 濃度的增加而降低,與葡萄腐爛直徑的變化趨勢一致。 Zhu等[17]發(fā)現(xiàn),釀酒酵母M114 菌懸液濃度越大,對葡萄上炭黑曲霉和赭曲霉的抑制作用越強(qiáng), 測得的OTA 含量也越小,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

    考慮到經(jīng)濟(jì)成本等因素,后續(xù)選用1×108細(xì)胞/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 進(jìn)行試驗(yàn)。

    圖3 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對紅提葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.3 Effect of Y. lipolytica Y-2 at different concentration on the lesion diameter of red globe grapes caused by T. rugulosus O1

    2.3 解脂亞羅酵母Y-2 處理對貯藏不同時間的紅提葡萄采后病害和OTA 的控制作用

    如圖5 所示, 對照組和經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2處理的紅提葡萄腐爛直徑均隨貯藏時間的延長而增加,尤其是對照組,葡萄腐爛直徑從14.2 mm(9 d)增到26 mm(17 d)。 而經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的葡萄腐爛直徑從11.8 mm(9 d)增到19.8 mm(17 d)。 相同時間,處理組葡萄腐爛直徑均顯著低于對照組,17 d 的葡萄腐爛直徑降低了23.8%。

    如圖6 所示,隨著貯藏時間的延長,解脂亞羅酵母Y-2 處理組和對照組紅提葡萄傷口處由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA 積累量均逐漸增加。Lahouar 等[18]發(fā)現(xiàn)塔賓曲霉(A. tubingensis)產(chǎn)生的OTA 也隨培養(yǎng)時間的增加而增加, 與本研究結(jié)果一致。 未經(jīng)解脂亞羅酵母Y-2 處理的對照組葡萄傷口處OTA 的積累量在第11 天迅速增至35.20 ng/傷口,第17 天達(dá)到最大值(60.20 ng/傷口);而經(jīng)該拮抗酵母處理的葡萄傷口處OTA 的積累量在同時間段分別為1.28 ng/傷口和29.1 ng/傷口,顯著低于對照組, 且處理組葡萄腐爛直徑也顯著低于對照組,表明解脂亞羅酵母Y-2 處理對葡萄貯藏過程中由微皺籃狀菌O1 產(chǎn)生的OTA 積累具有顯著的控制效果。對產(chǎn)毒菌微皺籃狀菌O1 的抑制作用是其原因之一。

    圖4 不同濃度解脂亞羅酵母Y-2 對葡萄傷口處OTA 積累的影響Fig.4 Effect of Y. lipolytica Y-2 at different concentration on OTA accumulation in the wounds of red globe grapes

    3 結(jié)論

    解脂亞羅酵母Y-2 對不同品種的葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的采后病害均有顯著的控制效果, 且能顯著降低紅提葡萄傷口處OTA 的積累。與對照相比,該酵母處理的夏黑、巨峰和紅提葡萄的腐爛直徑分別降低了28.7%,19.7%和18.5%,紅提葡萄傷口處OTA 積累量降低了83.3%。 OTA在葡萄傷口處積累的減少, 一方面是由于拮抗酵母抑制了產(chǎn)毒菌的生長, 另一方面是該酵母對產(chǎn)生的OTA 的降解作用。

    隨著酵母濃度的升高,解脂亞羅酵母Y-2 對紅提葡萄采后病害和OTA 的控制效果增強(qiáng),葡萄腐爛直徑和傷口處OTA 的積累量均減少。 當(dāng)酵母濃度為1×108細(xì)胞/mL 時, 紅提葡萄腐爛直徑比對照降低了23.8%, 傷口處OTA 積累量由50 ng/傷口,降到5.95 ng/傷口。

    圖5 解脂亞羅酵母Y-2 處理對貯藏不同時間的紅提葡萄由微皺籃狀菌O1 引起的腐爛直徑的影響Fig.5 Effect of Y. lipolytica Y-2 on lesion diameter of red globe grapes stored for different times

    圖6 解脂亞羅酵母Y-2 處理貯藏不同時間的紅提葡萄傷口處OTA 積累的影響Fig.6 Effect of Y. lipolytica Y-2 on OTA accumulation in the wounds of red globe grapes stored for different time

    在紅提葡萄貯藏過程中,相同時間,解脂亞羅酵母Y-2 處理組紅提葡萄腐爛直徑和OTA 積累量均顯著低于對照組,表明解脂亞羅酵母Y-2 在葡萄貯藏過程中對其采后病害和OTA 的積累均具有顯著的控制效果。

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